人α防御素5活性肽的基因工程制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人α防御素５活性肽的基因工程制备方法。本发明专利技术公开了含人α－防御素５活性肽基因的表达载体构建及其转化酵母克隆株的筛选、高密度发酵的方法和从发酵上清中分离纯化活性多肽的方法。本发明专利技术还公开了由上述方法获得的人α防御素５活性肽在多肽药物制备中的应用。本发明专利技术适用于工业化生产规模中经过简单的操作实现高效发酵表达和低成本、高效率地纯化制备具有高效杀灭多种病原细菌和抗ＨＰＶ等病毒的人α防御素５活性肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程制药领域，具体涉及一种具有杀灭细菌和抗病毒生物活性多肽-。
技术介绍
当前细菌和病毒感染仍然是人类生命和健康的主要威胁。自上世纪早期青霉素和磺胺药问世以来，人类已专利技术了近百种主要以干扰细菌的核酸或蛋白质的代谢与合成或抑制细菌胞壁合成的机理达到抗细菌目的的抗菌素，然而由于这些传统抗生素的作用机制容易诱导细菌发生突变而产生耐药性。临床实践中已发现针对传统抗生素的多种耐药菌株， 使得人类再次面临致病细菌的挑战。因此，人们一直在努力寻求与开发新型的抗菌素。另一方面，自从首例艾滋病病例的出现以来，又有SARS病毒、流感病毒、肝炎病毒、登革热病毒等病毒所致疾病的暴发与流行，使得人类的生命时常面临危机。由于病毒的基因很容易发生突变，病毒所致的损伤往往有宿主免疫系统的功能失误参与，至今人们尚未寻找到可长期使用且具有特效抗病毒的药物。因此除应用目前通过抑制病毒核酸或蛋白酶，或利用免疫因子杀伤病毒，或利用病毒疫苗免疫人体等机理生产的药物外，还必须寻找其他更为高效低毒的抗病毒药物。经过近二十年的研究，发现在植物、昆虫和包括人在内的高等动物机体内存在近千种内源性阳离子肽------防御素(Defensin) (Shalin Seebah et al，Nucleic AcidsResearch, 2007, 35 :262-268)。具有活性的防御素分子一般为3_6kD的非糖基化多肽，多数分子内存在6 8个保守半胱氨酸残基形成的3 4对链内二硫键外，还富含精氨酸、 脯氨酸等特殊残基，整个分子在中性溶液中带正电荷；晶体衍射揭示防御素分子具有α螺旋、β折叠、二硫键桥、无规卷曲等单种或多种二级结构所形成的单体或多聚体空间结构。 根据二硫键等结构的组成方式，防御素被分为α、β和θ等类型。研究已证实，有805种防御素具有快速、强效地杀灭多种细菌的活性；有261种防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋体的作用；有48种防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有M种防御素可产生抗癌细胞的生物效应。此外，防御素作为机体免疫系统的重要组成部分，参与了免疫调节等多种生物学功能。研究显示防御素的抗微生物活性与其结构相关，通过其所具有的净电荷、疏水性与亲水性、空间构象与极向角等因素构成的特征性机理杀伤细菌(Michiael R. et al, Pharmacol Rev, 2003, 55 :27-55)，因此防御素直接扰乱细菌胞膜的结构进而破坏胞膜的通透性和细胞能量状态，导致细胞膜去极化、呼吸作用受抑制，以及细胞ATP含量下降，最终致靶细菌死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒衣壳中的靶分子结合而导致病毒失去感染宿主细胞的生物活性(E Hazrati et al，J Immunol，2006，177 :8659-8666)。 由于这些特殊的作用机理，使防御素具备两个特点一是抗微生物谱广，二是靶微生物难以对其产生抗性突变。因此，生物学家认为防御素可能成为一种新型的抗生素，在作为抗感染制剂、食品防腐剂等方面具有广阔的应用前景。迄今为止，相继发现了 6种人α -防御素(HNP1_4，HD5，HD6)和6种人β -防御素(HBD1-6)。人α防御素5活性肽是分子量为3. 58KD的阳离子短肽，含保守的6个半胱氨酸残基，构成3个分子内二硫键，形成由3条稳定的折叠片构成的两歧性分子。研究发现，HD5除在人肠道潘氏细胞中大量分泌表达外；在生殖道上皮细胞、鼻粘膜和部分正常支气管粘膜等细胞中存在固有表达，还可因炎症、感染和细胞恶性转变等因素的刺激而表达、 分泌上调。研究表明，化学合成、从粘膜组织中提取和转基因小鼠表达的HD5不仅具有高效而广谱的抑菌和参与免疫保护调节的活性，而且具有阻止HIV、HSV等病毒粘附进入细胞和抑制病毒颗粒复制的抗病毒作用(N. H. Salzman et al, Nature, 2003,422 :522-526 ；Bryan Ericksen et al, Antimicrobial Agent andChemotherapy, 2005 :269-275 ；C. B.Buck et al, Proc Natl Acad Sci，2006，103 :1516-1521)。由此可见，HD5 在消化道、生殖道等粘膜内源性感染预防和免疫保护调节中发挥着重要作用。另一方面，HD5是机体与病原微生物相互作用过程的进化产物，其具有特异识别与杀伤病原微生物的活性，理论上对人体不会产生免疫抗体等毒副效应，因此HD5是具有良好开发前景的新型抗病原微生物的药物候选分子。科学家们发现并证实了人α防御素及其生物活性，并进一步地认识了 HIV、HPV等病毒和细菌感染的发病机制Chang et al, Science, 2002, 298 :995)，为传染病的防治提供了新的思路。但要将防御素真正应用于艾滋病等感染性疾病的治疗和预防，尚有很多工作要做。从人体内提纯的天然α防御素5具有很强的抗菌活性，但提取材料稀缺，成本极昂贵。化学合成法可方便地获得高纯度的人α防御素5活性肽，但合成产品仅呈线性需经过低效率的复性后才具有活性，故成本很高，且产量较低。因此，通过基因和蛋白质工程技术来改善生产效率和产物活性，已成为防御素研究和应用的关键。国外有数家制药公司在进行防御素的开发研究，但现有公开的文献表明因防御素分子太小、含特殊氨基酸较多及具有抗微生物活性等原因，目前制约防御素产品走上市场的主要瓶颈依然是尚未建立成本低廉、高效稳定的制备工艺。毕赤酵母表达系统是近年来兴起的一种真核高效表达系统，具备独特的优点菌体自身分泌蛋白较少，外源目的基因通过整合进入酵母细胞基因组中，结构比较稳定，特别是可对表达的外源蛋白进行翻译后修饰和加工，如二硫键的形成、糖基化等，在表达外源基因方面应用越来越广泛，并且已经建立了操作简单的合适培养方法。研究者也尝试过用植物表达系统和酵母表达系统等真核细胞制备抗菌肽。李元广等成功地将兔α防御素基因导入小球藻并获得了有生物活性的NPl (专利申请号03142195. 4，公开号cnl473846)。王兴权等利用毕赤酵母成功地实现了 CecA-mag抗菌肽的分泌表达(王兴权等，微生物学报， 2007,47:75-78)。基于毕赤酵母表达系统的优点和人α防御素5的生物活性需要空间结构(分子内3对二硫键稳定的β-折叠构象)的要求(E.de Leeuw et al, FEBSLett, 2007, 581 :515-520),理论上将采用特殊的技术构建人α防御素5重组表达载体并筛选出基因组中整合有高拷贝目的基因的酵母细胞转化克隆，进而建立起高效表达和纯化HD5活性肽的工艺，应该是一种理想的人防御素开发方向。
技术实现思路
本专利技术针对未见有利用酵母菌株生产人α防御素5活性肽的报道和现有技术重组制备小分子多肽的不足，提供一种适用于工业化生产规模的高效表达含天然N-端序列人α防御素5活性肽和低成本、高效率纯化制备活性多肽的方法，包括用于该方法的适宜 DNA序列、重组表达载体及其构建方法、酵母菌的高密度发酵与目的基因的诱导表达、发酵上清中目的肽的分离纯化方法和工艺主要技术路线。本专利技术所述的人α防御素5活性肽的制备方法，主要包括以下步骤1)目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人α防御素５活性肽的基因工程制备方法，其特征在于包括步骤：　１）目的基因的获取：克隆人α防御素５的ｃＤＮＡ编码序列，序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示；　２）将步骤１）所得目的基因插入穿梭质粒中，构建重组表达质粒；　３ ）将步骤２）所得重组表达质粒转化入酵母细胞中，筛选出基因组中整合有多拷贝目的基因的酵母克隆株；　４）高密度培养步骤３）所筛选的酵母克隆株，并用甲醇诱导目的基因的高效表达；　５）从步骤４）所获得的发酵上清中分离纯化人α防御素５活性 肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王艾平，王军平，粟永萍，程天民，王崧，申明强，陈默，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]