从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术适用于分子生物学技术领域，提供一种从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05

【技术实现步骤摘要】
从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的试剂盒及其方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的试剂盒及其方法。

技术介绍

[0002]寡核苷酸(小核酸)药物主要包括反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗体核酸偶联药物(ARC)等。小核酸药物是与小分子药物、抗体药物完全不同的全新药物类别，其药物构成为核苷酸序列，药物机制为通过和靶基因mRNA碱基互补配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，在转录后水平调控蛋白表达，从而实现治疗疾病的目的。寡核苷酸药物中的小核酸具有选择性，但仍面临血清不稳定、膜通透性低和缺乏组织选择性等挑战。而抗体具有更长的半衰期、在细胞内选择性递送药物的能力以及其靶向特性，被证明是靶向递送寡核苷酸的理想载体之一，抗体偶联小核酸(AOC，Antibody Oligonucleotide Conjugate)即将抗体作为靶向递送寡核苷酸的载体，主要有三部分构成：发挥组织靶向作用的抗体、连接子(linker)和作为payload的小核酸。其中小核酸包括正义链和反义链，其中正义链通过共价键偶联在抗体上，反义链通过碱基互补配对与正义链形成双链。小核酸在人体内的组织和血液分布决定着AOC药物的药效，然而传统的小核酸提取试剂盒通过蛋白变性、离心等方法去除蛋白质等杂质，然后分离得到小核酸，而由于AOC药物是抗体通过共价键偶联小核酸药物，因此使用传统的方法会将抗体上偶联的小核酸去除，难以将AOC药物上的小核酸分离提取出来，因此市场上缺少高效的试剂盒或方法检测AOC药物小核酸的血液分布。

技术实现思路

[0003]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的试剂盒及其方法。
[0004]为实现本专利技术目的，本专利技术提供一种从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05
‑
0.09M磷酸盐缓冲液、0.5
‑
1.5M氯化钠和0.1
‑
0.4％ TritonX
‑
100，所述裂解液Ⅰ的pH为6.0
‑
7.0，所述裂解液Ⅱ包括50
‑
150μg/ml蛋白酶K、20
‑
80mM Tris
‑
HCl和7
‑
13nM氯化钙，所述裂解液Ⅱ的pH为7.0
‑
8.0，所述工作液包括200
‑
300mM Tris
‑
HCl、350
‑
400mM氯化钾、10
‑
20nM氯化镁、0.05
‑
0.15M DTT、20
‑
60u/μL RNase抑制剂和0.5
‑
5U逆转录酶，所述工作液的pH为8.0
‑
8.6。
[0005]进一步的，所述裂解液Ⅰ由0.07M磷酸盐缓冲液、1M氯化钠和0.25％TritonX
‑
100组成，所述裂解液Ⅰ的pH为6.5。
[0006]进一步的，所述裂解液Ⅱ由125μg/ml蛋白酶K、50mM Tris
‑
HCl和10nM氯化钙组成，所述裂解液Ⅱ的pH为7.5。
[0007]进一步的，所述工作液由250mM Tris
‑
HCl、375mM氯化钾、15nM氯化镁、0.1M DTT、
40u/μL RNase抑制剂和1U逆转录酶组成，所述工作液的pH为8.3。
[0008]本专利技术还提供一种使用如上述的试剂盒从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的方法，包括以下步骤：
[0009]S1.收集全血于EDTA抗凝管中，4℃1500g离心15min，收集血浆
‑
80℃冰箱保存；
[0010]S2.取S1中的血浆，按照1：4的比例加入所述裂解液Ⅰ；
[0011]S3.加入所述裂解液Ⅱ，混匀后55℃孵育30分钟，然后95℃变性10分钟，随后冰上迅速冷却；
[0012]S4.4℃4000g离心20分钟，取上清稀释10倍；
[0013]S5.将上清加入到逆转录反应体系中进行逆转录，之后以逆转录得到的核酸片段为模板进行qPCR反应，得到CT值结果；
[0014]S6.使用PBS稀释AOC药物，从最高浓度点4倍梯度稀释，10个浓度点，之后将各浓度点的稀释液按S2
‑
S5的步骤操作，得到各浓度点的稀释液的CT值结果，根据各浓度点和对应的CT值结果绘制标准曲线；
[0015]S7.将S5得到的CT值代入S6制备的标准曲线中，得到AOC药物小核酸的浓度。
[0016]进一步的，所述逆转录反应体系包括10μL工作液、50nM antisense stem
‑
loop茎环逆转录引物，最后ddH2O补足到10μL；所述逆转录的反应条件为16℃30min，42℃30min，85℃5min；所述逆转录采用的antisense stem
‑
loop茎环逆转录引物的序列组成为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTCCTA(SEQ ID NO.1)。
[0017]进一步的，所述S5和S6中qPCR反应体系为：5μL 1x TaqMan Universal PCR Master Mix、0.2mM antisense Probe、1.5mM antisense F、0.7mM reverse和1μL模板，最后ddH2O补足到10μL；qPCR反应的程序为：95℃处理10分钟后进入循环：95℃处理15秒，60℃处理1分钟，共40个循环；所述qPCR采用的antisense F的序列组成为GCGCATAAAATCTACAGTCA(SEQ ID NO.2)，reverse的序列组成为GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.3)，antisense Probe的序列组成为FAM
‑
CGCACTGGATACGACATTCC
‑
MGB(SEQ ID NO.4)。
[0018]本专利技术还提供一种如上述的试剂盒在分离提取检测血液中的AOC药物小核酸的用途。
[0019]进一步的，使用qPCR技术检测AOC药物小核酸的浓度以评估AOC药物的药效。
[0020]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0021]本专利技术提供一种从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，利用本专利技术的试剂盒分离小核酸，先加入裂解液Ⅰ，释放出细胞内抗体偶联的小核酸或多肽偶联的小核酸或小核酸，再加入裂解液Ⅱ，裂解液Ⅱ的蛋白酶K能切割AOC药物的蛋白端，将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，其特征在于，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05
‑
0.09M磷酸盐缓冲液、0.5
‑
1.5M氯化钠和0.1
‑
0.4％TritonX
‑
100，所述裂解液Ⅰ的pH为6.0
‑
7.0，所述裂解液Ⅱ包括50
‑
150μg/ml蛋白酶K、20
‑
80mM Tris
‑
HCl和7
‑
13nM氯化钙，所述裂解液Ⅱ的pH为7.0
‑
8.0，所述工作液包括200
‑
300mM Tris
‑
HCl、350
‑
400mM氯化钾、10
‑
20nM氯化镁、0.05
‑
0.15M DTT、20
‑
60u/μL RNase抑制剂和0.5
‑
5U逆转录酶，所述工作液的pH为8.0
‑
8.6。2.如权利要求1所述的从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，其特征在于，所述裂解液Ⅰ由0.07M磷酸盐缓冲液、1M氯化钠和0.25％TritonX
‑
100组成，所述裂解液Ⅰ的pH为6.5。3.如权利要求1所述的从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，其特征在于，所述裂解液Ⅱ由125μg/ml蛋白酶K、50mM Tris
‑
HCl和10nM氯化钙组成，所述裂解液Ⅱ的pH为7.5。4.如权利要求1所述的从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，其特征在于，所述工作液由250mM Tris
‑
HCl、375mM氯化钾、15nM氯化镁、0.1M DTT、40u/μL RNase抑制剂和1U逆转录酶组成，所述工作液的pH为8.3。5.一种使用如权利要求1
‑
4任一项所述的试剂盒从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.收集全血于EDTA抗凝管中，4℃1500g离心15min，收集血浆
‑
80...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛飞，
申请(专利权)人：迦进生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：