一种单细胞全基因组测序文库的构建方法技术

本发明专利技术提供一种单细胞基因组测序文库的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：所述的构建方法包括如下步骤：1)提供微腔室，所述微腔室包含单细胞的全基因组DNA；2)在所述微腔室内，加入携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂进行扩增，得到含有索引条形码的全基因组扩增产物；3)纯化，得到所述单细胞全基因组测序文库。本发明专利技术在单细胞全基因组扩增的过程中，引入细胞特异性条形码序列，在实现单细胞全基因组扩增的同时，给每个单细胞全基因组扩增产物标识上细胞特定的识别索引条形码，后续连接上接头进行三代测序，可以实现单倍型分辨率的复杂基因组组装和宏基因组的组装。率的复杂基因组组装和宏基因组的组装。

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞全基因组测序文库的构建方法


[0001]本专利技术属于单细胞测序领域，特别是涉及一种单细胞全基因组测序文库的构建方法。

技术介绍

[0002]自然界中，复杂的生物系统是由多种不同类型的细胞组成的，且生物系统的生物学功能依赖于单细胞之间的协同作用。传统的研究方法以细胞群体作为研究对象，虽然可以获得大量的基因组成或转录组数据，但是无法揭示造成这种复杂性的细胞异质性。而近些年来兴起的单细胞测序技术，通过基于高通量的测序方法，可在单细胞层次上分析单细胞的转录组、基因组以及蛋白质组的信息，分析细胞间的异质性，便于研究者认识并理解复杂生物系统，揭示生命的奥秘。
[0003]目前的单细胞测序技术仍然依赖于二代测序方法。以单细胞全基因组测序为例，首先需通过一定的技术，例如微流控技术、流式细胞分选或人工分选等技术，将细胞分离捕获在独立空间内；接着，在独立空间内，对单细胞进行裂解获取单细胞的基因组DNA，裂解方法可为超声波粉碎、酶裂解等；最后，根据二代测序文库建库流程，其中包括全基因组扩增、扩增产物索引化、扩增产物片段化、加上二代测序接头等步骤，构建出二代测序文库，再上机进行测序分析。然而，在二代测序为基于短读段的测序技术中，单个DNA分子必须扩增成相同的DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度，从而读出DNA序列，而随着读段增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，限制了二代测序的读段长度(不超过600bp)，因此，为保证测序质量，需对基因组进行片段化操作。此外，二代测序获得的读段通常较短，在进行未知物种基因组的从头拼接时，利用测序数据组装出的重叠群，由于读段尺寸太小，无法识别更大的基因组重复序列，因而阻碍了复杂基因组的组装和单倍型遗传基因信息的解析；在宏基因组中，由于测序复杂度高，序列覆盖率较低，测序所得短序列通常无法重叠，因而导致了宏基因组组装的困难，从而使得从微生物群落中索引全长基因和代谢途径困难重重。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种单细胞全基因组测序文库的构建方法。
[0005]本专利技术第一方面提供一种单细胞全基因组测序文库的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
[0006]1)提供微腔室，所述微腔室包含单细胞的全基因组DNA；
[0007]2)在所述微腔室内，加入携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂进行扩增，得到含有索引条形码的全基因组扩增产物；
[0008]3)纯化，得到所述单细胞全基因组测序文库。
[0009]优选的，所述携带有索引条形码的随机引物的长度为2～99个碱基。
[0010]优选的，所述携带有索引条形码的随机引物包含条形码序列和随机引物序列。
[0011]优选的，所述微腔室的体积大小为皮升至纳升。
[0012]优选的，所述微腔室选自微液滴、凝胶微球、半透膜体系、脂质体体系、微孔板或离心管。
[0013]更优选的，当微腔室为微液滴时，将携带有索引条形码的随机引物和扩增反应试剂加入于所述微液滴内。
[0014]进一步优选的，所述携带有索引条形码的随机引物通过微液滴或微球的形式加入于所述微腔室内。
[0015]进一步优选的，所述扩增试剂通过微液滴或微球的形式加入于所述微腔室内。
[0016]更进一步优选的，所述加入的方法采用液滴融合法或液滴注射法中的一种或两种。
[0017]更优选的，当微腔室为凝胶微球时，将所述凝胶微球还原为凝胶液滴，将携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂加入于所述凝胶液滴内。
[0018]进一步优选的，还原时，采用还原剂进行处理。较佳地的，所述还原剂选自二硫苏糖醇、巯基乙醇和三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐中的一种或多种。
[0019]进一步优选的，所述携带有索引条形码的随机引物通过微液滴或微球的形式加入于所述微腔室内。
[0020]进一步优选的，所述扩增试剂通过微液滴或微球的形式加入于所述微腔室内。
[0021]更进一步优选的，所述方法采用液滴融合法或液滴注射法中的一种或两种。
[0022]优选的，1)中，单细胞的捕获于所述微腔室，裂解获得单细胞的全基因组DNA。
[0023]更优选的，单细胞的捕获方法选自限稀释法、显微操作法、荧光流式分选法、微液滴生成法、激光显微切割法或毛细管挑取法中的一种或多种。
[0024]更优选的，裂解的方法包括变性反应、酶裂解法、碱裂解法、热休克法和超声波处理法中的一种或多种。
[0025]优选的，2)中，所述扩增方法选自PCR扩增、MDA扩增和MALBAC扩增中的一种或多种。
[0026]优选的，所述构建方法还包括将纯化后产物与接头序列连接。
[0027]优选的，所述扩增试剂还包括焦磷酸酶。申请人发现在扩增时加入焦磷酸酶能提高扩增效率。
[0028]本专利技术的单细胞全基因组测序文库的构建方法，具有以下有益效果：
[0029]本专利技术在单细胞全基因组扩增的过程中，使用带有索引条形码序列的引物(长度为2～99个nucleotides)替代了普通的随机引物，在实现单细胞全基因组扩增的同时，给每个单细胞全基因组扩增产物标识上细胞特定的索引条形码，后续连接上接头进行测序，可以实现单倍型分辨率的复杂基因组组装和宏基因组的组装。
附图说明
[0030]图1显示为本专利技术的单细胞全基因组测序文库构建方法流程图。
[0031]图2显示为本专利技术的实施例1中包裹有单个施瓦氏菌的微液滴图。
[0032]图3显示为本专利技术的实施例1中MDA反应后，包含有单细胞全基因组扩增产物的微
液滴图(有箭头)。
[0033]图4显示为本专利技术的基于三代的实施例1构建文库的测序分析图。
[0034]图5显示为基于二代的单细胞全基因组测序的分析图。
具体实施方式
[0035]现有技术中扩增和条形码化分步进行，步骤比较繁琐且测序的读段比较短。申请人偶然发现在原微反应体系中扩增和条形码化同步进行，然后利用三代测序平台进行测序分析，可实现高覆盖率、高精确度的单细胞水平的基因组组装。在此基础上完成了本专利技术。
[0036]本专利技术：1)通过微流控技术将单细胞捕获于单一微反应体系(微腔室)中，进行裂解反应(亦可不进行裂解反应)；2)在原微反应体系(微腔室)中，通过相关技术，加入扩增反应体系(包含携带有可索引条形码序列的随机引物、携带有可索引条形码序列的随机引物的长度为2～99个nucleotides、扩增试剂)，原位进行单细胞全基因组扩增和基因组扩增产物的索引化反应；3)加上接头序列，完成单细胞全基因组测序文库的构建，并进行测序，测序后进行单细胞全基因组学分析，本申请的方法构建的单细胞全基因组测序文库尤其适用于三代测序。
[0037]如图1所示，本专利技术保护一种单细胞全基因组测序文库的构建方法，所述的构建方法包括如下步骤：
[0038]1)提供微腔室，所述微腔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单细胞全基因组测序文库的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：1)提供微腔室，所述微腔室包含单细胞的全基因组DNA；2)在所述微腔室内，加入携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂进行扩增，得到含有索引条形码的全基因组扩增产物；3)纯化，得到所述单细胞全基因组测序文库。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：A1)所述携带有索引条形码的引物的长度为2～99个碱基；A2)所述携带有索引条形码的引物包含条形码序列和随机引物序列；A3)所述微腔室选自微液滴、凝胶微球、半透膜体系、脂质体体系、微孔板或离心管；A4)所述微腔室的体积大小为皮升至纳升。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下技术特征中的任一项：B1)当微腔室为微液滴时，将携带有索引条形码的随机引物和扩增反应试剂加入所述微液滴内；B2)当微腔室为凝胶微球时，将所述凝胶微球还原为凝胶液滴，将携带有索引条形码的随机引物和扩增试剂加入所述凝胶液滴内。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述携带有索引条形码的随机引物通过微液滴或微球的形式加入所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一凡，张蓉，李婕，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：