一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi-C建库方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi

【技术实现步骤摘要】
一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi
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C建库方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别涉及一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi
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C建库方法及应用。

技术介绍

[0002]Hi
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C技术是以3C技术“邻近连接”为基础，结合高通量测序，在全基因组范围捕获所有特异和非特异的染色质相互作用。通过生物信息学分析方法，可以研究获得全基因组范围内染色质一维互作连接图、二维相互作用频率热图、全基因组染色质相互作用调控网络和三维结构可视化信息(ErezLieberman
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Aiden, 2009, Science; Luca Giorgetti, 2016, Nature)，还能进行基因组单体型分析（Jan O Korbel, 2013, Nature Biotechnology）和辅助基因组组装(Joshua N Burton et al., 2013, Nature Biotechnology)。
[0003]当前对人类、畜禽肠道微生物的鉴定，主要有两种方法，包括 16S rDNA 测序和宏基因组 Shotgun 二代测序。16S rDNA 测序能以较低的成本对人类、畜禽肠道菌群进行分析，不足之处是只能精确到细菌的属以及属以上的水平，对于种以及种以下水平无法分辨，而且只得到了菌群中每种微生物的16S rDNA 的序列，无法得到微生物的全部基因组信息。宏基因组 Shotgun 技术依赖二代测序，产生的大量短片段的冗余序列无法归类到物种和菌株水平 (Bickhart et al.,2021)(CN111909983A)，这造成了测序数据资源的浪费并且丢失了许多菌株的基因组信息。Hi
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C技术辅助基因组组装，并与 PacBio HiFi 三代测序技术结合，在高质量基因组组装中产生了非常好的效果 (Zhou et al., 2020a)，在宏基因组组装中具有很大的应用潜力。如果在宏基因组组装中应用Hi
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C技术，将取得很好的效果（与不同细胞/微生物相比，来源于同一个细胞/微生物内的DNA分子互作更强，基于此原理可将来自于同一种微生物的序列聚类到同一个簇群中，并对簇群进行物种/细胞鉴定。因此，可将宏基因组聚类到物种和菌株水平）。常规的Hi
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C高通量测序建库以动物细胞系作为研究对象，细胞系细胞种类相同，染色质状态雷同，染色质互作模式和构象较为一致，更容易获得比较好的结果。微生物群体相较于细胞系，微生物群体内个体基因组染色质状态复杂多变，且微生物具有坚实的细胞壁，细胞不易裂解。因此，适用于细胞系的Hi
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C技术无法直接用于复杂的微生物群体。
[0004]专利文件CN109056078A、CN111909983A分别公开了一种适用于单一细菌的Hi
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C高通量测序建库方法、一种适用于微生物宏基因组Hi
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C高通量测序建库方法。在专利文件CN109056078A中公开了单一细菌的Hi
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C高通量测序建库方法，但是在复杂的现实环境中，基本不存在单一细菌的情况，现实微生物环境中，不仅包括泥沙、无机盐、土壤、种植物残留物等，需要分离出较为纯净的微生物都十分不易，而且分离出的微生物也包括了细菌、真菌等集合，更不用说分离出单一的细菌，就难度更大了，且研究宏基因组的时候更不能分离出一个个单一细菌进行研究，所以专利文件CN109056078A中公开的方法限制了其在实际操作和针对宏基因组研究中的应用。而在专利文件CN111909983A中虽然公开了一种适用于微生
物宏基因组学Hi
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C高通量测序建库方法，但是其微生物细胞内染色质交联效果欠佳，单一酶切针对微生物群体片段化效果欠佳，且建库效率中间过程中文库的损失和大量噪音的存在均限制了其应用，有待进一步优化，来提高建库效率、建库质量和测序数据质量，以获得更大范围的应用。
[0005]因此，有必要改良优化出一种更适用于微生物群体的宏基因组GutHi
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C技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi
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C建库方法及应用，以解决上述问题。
[0007]根据本专利技术的第一个方面，提供了一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi
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C建库方法，该方法包括如下步骤：1）微生物分离提纯：微生物样本洗涤，添加培养基并自然沉降，4000g离心力对微生物分离；2）微生物进行裂解及甲醛交联；3）对步骤2）中产物进行酶切，然后用混有生物素标记的碱基对酶切后黏性末端进行补平，并将互作DNA邻近连接；4）将步骤3）中获得产物纯化后，加入环状共沉淀DNA，互作DNA超声片段化；5）基于生物素富集邻近互作片段，在免疫磁珠上进行末端修复与加A并与接头连接；6）进行文库预扩增QC质量控制检验，将检验筛选出的最优扩增条件进行正式扩增即得到GutHi
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C文库。
[0008]本方法中引入环状共沉淀DNA控制步骤，可以将DNA处理过程可视化，减少建库中宏基因组DNA损失；同时DNA正式扩增前进行QC质量控制检验，可以获得最优的扩增条件，提高GutHi
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C文库的准备比例和避免试剂浪费。更重要的，本方法是经过优化的GutHi
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C文库构建方法，构建出来的GutHi
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C文库在进行高通量测序时，其数据的比对率（指唯一比对率）、有效数据产出率、Hi
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C试验目标序列比例、多重比对率、未比对率均优于期刊上发表的文章（Derek M. Bickhart et al,Nature Biotechnology,2022）中方法做出的数据，也优于CN111909983A专利中方法做出的数据，说明本申请的GutHi
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C文库构建方法更有优势，构建的GutHi
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C文库质量更好，具体表现在：GutHi
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C引入了in situ Hi
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C框架， 与传统Hi
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C相比，保留了染色质原始微环境，拥有更高的接触频率和更低的背景噪音等优点，可以降低“反式互作”噪音，为提高有效数据的比例发挥作用；优化各个步骤，降低了Dangling_end比例，提高了有效数据的比例。即便在初始组装质量不好，产生较多的Contig情况下，本申请中GutHi
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C技术依然可以产生较高的顺式互作，在完整宏基因组辅助组装中具有较大应用潜力。
[0009]在某些实施方式中，所述方法步骤2）中采用先微生物裂解，再甲醛交联的先后顺序，可以提高甲醛交联的效果，避免完整细胞壁的阻隔使得甲醛对微生物拟核染色质的交联反应不充分。由此，可以显著提高GutHi
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C文库测序后数据的唯一比对率，且是期刊（Derek M. Bickhart et 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于微生物群体的宏基因组GutHi
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C建库方法，其中，所述方法包括如下步骤：1）微生物分离提纯：微生物样本洗涤，添加培养基并自然沉降，4000g离心力对微生物分离；2）微生物进行裂解及甲醛交联；3）对步骤2）中产物进行酶切，然后用混有生物素标记的碱基对酶切后黏性末端进行补平，并将互作DNA邻近连接；4）将步骤3）中获得产物纯化后，加入环状共沉淀DNA，互作DNA超声片段化；5）基于生物素富集邻近互作片段，在免疫磁珠上进行末端修复与加A并与接头连接；6）进行文库预扩增QC质量控制检验，将检验筛选出的最优扩增条件进行正式扩增即得到GutHi
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C文库。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法步骤2）中采用先微生物裂解，再甲醛交联的先后顺序。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述微生物裂解是采用液氮研磨和/或溶菌酶裂解的方法进行。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述微生物裂解仅采用溶菌酶裂解的方法进行时，可以降低文库损失，提高文库DNA浓度，更适于微生物群体量小时使用。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔思远，张玉波，李晨莹，卢宇曦，杨金宝，潘玮华，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：