一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法，属于微生物技术领域。包括将土壤样品与PBS缓冲液混合、振荡，得到土壤菌悬液；将土壤菌悬液与叠氮溴化丙锭溶液混合、暗孵育，得到暗孵育物等步骤。将PMA核酸染料应用于复杂土壤样品活性微生物群筛选的实验步骤具体化；暗孵育和曝光反应过程中充分振荡PMA

【技术实现步骤摘要】
一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，特别是涉及一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法。

技术介绍

[0002]活性微生物是指具有或潜在具有生长代谢特性和适应改变既定环境能力的微生物(Emerson et al.,2017)，也是土壤微生物生态学中微生物分离培养或功能鉴定的主要目标。然而，尽管高通量测序技术已成为研究土壤微生物多样性及其群落结构的重要工具(Rinke et al.,2013)，但基于非选择性鉴定活性微生物的土壤总DNA扩增测序无法反映出土壤中真实的活性微生物群，且很可能高估了土壤中活性微生物的种类和数量(Dlott et al.,2015)。这是因为，土壤微生物总DNA主要包括：1)活细胞DNA，具有代谢活性且可培养的完整细胞(Nocker et al.,2009)；2)休眠细胞DNA，低代谢活性且不可培养的活细胞和抗生素持留菌细胞，但在一定条件下可恢复其代谢活性和可培养性的完整细胞(Ayrapetyan et al.,2018)；3)死细胞DNA，包括细胞膜受损且正在裂解的和已死亡的非完整细胞(Nebe
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Caron et al.,2000)；4)胞外DNA，包括游离DNA和吸附于土壤颗粒上的DNA(Levy
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Booth et al.,2007)。因此，如何准确鉴定并量化土壤中的活性微生物群，是当前土壤微生物生态学研究中亟待解决的关键问题。
[0003]细胞膜的完整性作为微生物活性的判断标准为许多研究者所接受(Gr
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gori et al.,2001；Emerson et al.,2017)。基于细胞膜完整性的活性微生物筛选方法中，碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是最早被广泛用于活菌筛选的核酸染料(Williams et al.,1998)，它只能穿透受损的细胞膜并在嵌入双链DNA后释放红色荧光，通常结合荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜或流式细胞仪进行活性细胞检测(Nicoletti et al.,1991；Pietkiewicz et al.,2015)。但是，PI染料的应用也存在一些限制和弊端，它会将某些正在生长的活性细胞染色，如Sphingomonas sp.(Shi et al.,2007)，此外，使用PI染料处理后的样品不能够应用于后续DNA扩增测序中，即PI染料不适用于复杂环境样品中活性微生物群落结构的研究。Nogva等(2003)和Nocker等(2006)先后提出了EMA(Ethidium Monoazide Bromide)/PMA(Propidium Monoazide)核酸染料可用于筛选活性微生物，与PI类似，EMA/PMA染料被阻隔在活菌的完整细胞膜之外，而与胞外DNA和膜受损的非活性细胞DNA不可逆共价结合，最后阻断其DNA分子的PCR扩增反应。由于结合EMA/PMA染料的DNA分子被永久修饰，筛选出的活性微生物可用于后续DNA测序等多组学研究，使得该方法得到了广泛应用(Elizaqu
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vel et al.,2013；Emerson et al.,2017)。然而，EMA染料在随后的多数实验中被发现具有一定细胞毒性，会结合Mycobacterium avium等某些活菌DNA(Nocker et al.,2006)，这是因为具有一个正电荷的EMA(PMA具有两个正电荷)更易穿透活菌细胞膜(Fittipaldi et al.,2012)，导致实验出现假阴性结果，使得PMA在选择性筛选活性微生物方面更具优势。
[0004]目前，利用PMA检测活性微生物的方法大多应用于水体、纯菌株或食品微生物的检
验检疫中(Nocker et al.,2009；Elizaqu
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vel et al.,2013；Gomez
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Alvare et al.,2014)。PMA对DNA具有高度亲和性，在暗培养过程中可高效穿透死细胞的细胞膜，与暴露出来的DNA产生共价交联。随后在可见光(最大吸收波长460nm左右)的作用下，PMA所携带的光敏性叠氮基团会转化为高反应性的氮宾自由基，并与其结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价碳氮键，致使DNA分子被永久修饰，最后阻断DNA分子后续的PCR扩增等反应。同时那些残留在溶液中没有与DNA分子发生交联的PMA，在强光照射下可与水分子反应生成没有活性的羟胺(Nocker et al.,2006)。以上过程均在环境样品DNA提取之前完成，由于PMA不能穿透活性细胞完整的细胞膜，故不会影响后续活性微生物的DNA提取和PCR扩增，最终使relic DNA在核酸纯化中被选择性剔除。
[0005]利用PMA核酸染料法筛选复杂土壤样品中的活性微生物群相对较少，且缺乏具体的实验流程。同时，由于PMA染料的最佳激发波长是464nm，在以往的实验中，通常将样品放置距离光源20cm的冰上并使用500～650W卤素灯持续照射或明暗循环照射样品2～5分钟，来激发PMA与DNA分子的共价结合。但卤素灯的光强度和光谱特性不易调控，且过高的照射温度很可能会损坏活菌细胞膜或造成塑料离心管熔化，增加了实验结果的不确定性。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法，将叠氮溴化丙锭应用到筛选土壤活性微生物中，使用PMA
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LED光解仪，可热稳定的诱导交联PMA
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DNA，使得实验过程更加简便、安全和高效。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法，包括以下步骤：
[0009]1)将土壤样品与PBS缓冲液混合、振荡，得到土壤菌悬液；
[0010]2)将所述步骤1)得到的土壤菌悬液与叠氮溴化丙锭溶液混合、暗孵育，得到暗孵育物；
[0011]3)将所述步骤2)得到的暗孵育物置于PMA
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LED光解仪中曝光，得到曝光物；
[0012]4)提取所述步骤3)得到的曝光物的DNA，通过生物学实验确定土壤样品中活性微生物。
[0013]优选的，所述步骤1)土壤样品的质量与PBS缓冲液的体积比为0.5g:49.5mL。
[0014]优选的，所述PBS缓冲液的制备方法包括：将0.1mol/L的磷酸氢二钾溶液和0.1mol/L的磷酸氢二钠溶液以体积比为2:3混合，得到；
[0015]所述PBS缓冲液的pH值为6.98。
[0016]优选的，所述步骤1)振荡的条件包括：转速为150rpm，时间为30min。
[0017]优选的，所述土壤菌悬液与叠氮溴化丙锭溶液的体积比为49:1；
[0018]所述叠氮溴化丙锭溶液的浓度为2mmol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用叠氮溴化丙锭筛选土壤中活性微生物群的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将土壤样品与PBS缓冲液混合、振荡，得到土壤菌悬液；2)将所述步骤1)得到的土壤菌悬液与叠氮溴化丙锭溶液混合、暗孵育，得到暗孵育物；3)将所述步骤2)得到的暗孵育物置于PMA
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LED光解仪中曝光，得到曝光物；4)提取所述步骤3)得到的曝光物的DNA，通过生物学实验确定土壤样品中活性微生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)土壤样品的质量与PBS缓冲液的体积比为0.5g:49.5mL。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的制备方法包括：将0.1mol/L的磷酸氢二钾溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡晓婧，王光华，刘俊杰，刘株秀，顾海东，
申请(专利权)人：中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心，
类型：发明
国别省市：