评估TfR1抗体血液安全性的试剂盒制造技术

本发明专利技术适用于分子生物学技术领域，提供了一种用于进行TfR1抗体血液安全性评估的试剂盒，包括试剂R1和试剂X。其中，所述试剂R1为标记的Human Transferrin protein抗原；所述试剂X为R2或R3，其中，所述试剂R2为AF2474，所述R3为不和Tf识别相同抗原结合位点的TfR1抗体。所述试剂盒还包含样品稀释液、底物显色液、终止液和/或浓缩洗涤液。本发明专利技术还提供了进行TfR1抗体血液安全性评估的方法，所述方法包括：1）将试剂X包被于酶标板中；2）将试剂R1加入酶标板；3）按照梯度稀释依次加入待测抗体；4）加入HRP标记的SA；5）加入快速显色指示剂；6）测量吸光度OD值，绘制曲线，进行评估。本发明专利技术提供的试剂盒能灵敏、准确地评价TfR1抗体血液安全性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
评估TfR1抗体血液安全性的试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及一种评估TfR1抗体血液安全性的试剂盒及筛选TfR1抗体的方法。

技术介绍

[0002]转铁蛋白又名运铁蛋白（Transferrin，Tf）是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，其以三价铁复合物（TRF
‑
Fe
³
）的形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。转铁蛋白受体（Transferrin receptor，TfR）是机体介导铁代谢的重要蛋白质分子，在铁的运输、转化和利用中起着关键作用。
[0003]转铁蛋白Tf结合铁是通过与其受体TfR1相互作用而实现的。Tf与Fe
3+
相互作用形成全铁
‑
Tf，并与TfR1受体结合，在细胞内吞作用下进入核内体。在偏酸性核内体的环境中，Fe
3+
与Tf分离，同时STEAP3将Fe
3+
还原为Fe
2+
，并被二价金属离子转运蛋白1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）转运到细胞质中，然后释放了Fe
3+
的Tf与TfR1组成Tf/TfR1复合物，通过胞吐作用回游到细胞表面。在细胞表面，转铁蛋白Tf与受体TfR1分离，成为脱铁
‑
Tf，然后再与Fe
3+
重新结合参与铁循环，整个过程完成后Tf和TfR1被循环利用，进入细胞摄取铁的下一个周期中。
[0004]目前已知两种不同类型的转铁蛋白受体即转铁蛋白受体1（TfR1）和转铁蛋白受体2（TfR2）。转铁蛋白受体是由两个大小约为90kDa的亚单位通过两条二硫键交联而成的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白。每个单体含760个氨基酸，分子量为90～95kDa，包含一个大的胞外C端区域（671个氨基酸)、一个单跨膜区域（28个氨基酸）及一个短的N端区域（61个氨基酸）。C端区域是一个外功能区，它包含转铁蛋白（Tf）的结合位点、3个N连接糖基化位点及一个O连接糖基化位点，这些位点的糖基化作用是TfR1功能所必需的。
[0005]TfR在正常组织细胞中表达较低，而在肿瘤细胞表面表达增加，由于肿瘤细胞增长快速，需要合成更多DNA，核苷酸还原酶需要更多的辅因子铁，从而迫使肿瘤细胞上调TfR的表达。文献报道证明，肿瘤细胞表面的TfR与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10～100倍。同时，TfR的表达水平与肿瘤的分期和预后息息相关。TfR在肿瘤细胞高表达，相对特异性强，其胞外段捕捉配体转铁蛋白（transferrin, Tf）后介导内吞。这些特征使TfR成为抗肿瘤靶向治疗中的热点靶点之一。目前已设计有各种TfR1靶向抗体，被试图用于抑制肿瘤细胞生长，大多数TfR1抗体要么起运输作用，要么直接抑制受体功能。
[0006]但当TfR1抗体与TfR1结合时，如果侵占了TfR1和Tf复合体上Tf与Fe
3+
的结合位点，会使得其转铁功能受阻，进而影响人体健康。因此评估TfR1抗体的血液安全性显得尤为重要。而目前市面上并没有能够快速且准确进行TfR1抗体血液安全性评估的试剂盒及方法，因此，有必要设计一种临床前快速且准确进行TfR1抗体血液安全性评估试剂盒及方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术实施例的目的在于提供一种临床前快速且准确进行TfR1抗体血液安全性
评估的试剂盒，该试剂盒包括试剂R1和试剂X。
[0008]具体地，所述试剂R1为用Biotin标记的Human Transferrin R/CD71抗原，其在酶标板上的包被浓度为0.05~1 μg/mL。
[0009]具体地，所述试剂X为试剂R2或试剂R3。
[0010]具体地，所述试剂R2优选为AF2474抗体，其结合Human Transferrin R/CD71抗原，且同时和Transferrin（Tf）识别相同抗原结合位点。
[0011]具体地，所述试剂R3是和Human Transferrin R/CD71抗原结合的抗体，同时不和Transferrin（Tf）识别相同抗原结合位点。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包含样品稀释液、底物显色液、终止液和/或浓缩洗涤液。
[0013]具体地，所述样品稀释液为CBS（pH9.2~9.6的碳酸盐缓冲液）。
[0014]具体地，所述底物显色液为双组分TMB显色液。
[0015]具体地，所述终止液为1 M盐酸溶液。
[0016]具体地，所述浓缩洗涤液为含0.05%吐温20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
[0017]本专利技术实施例的目的还在于提供一种筛选TfR1抗体的方法，该方法筛选的抗体具有血液安全性，该方法包括：1）将试剂X包被于酶标板中；2）将试剂R1加入封闭后的酶标板；3）按照4倍梯度稀释依次加入待测抗体；4）加入HRP标记的链霉亲和素磁珠(SA)；5）加入快速显色指示剂；6）测量吸光度OD值，并绘制拟合曲线，根据结果对抗体进行筛选。
[0018]具体地，所述待测样品为TfR1抗体，可以是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、或抗体片段，可以是具有特定组织靶向性的长度不少于10个氨基酸的蛋白质，可以是环状或线性的多肽。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1）本专利技术提供的试剂盒具有检测灵敏度高、特异性强、检测重复性高和稳定性好等优点，能灵敏、准确地评价TfR1抗体血液安全性，可用于提供准确的治疗药物监测数据，实现TfR1药物的精准治疗。
[0020]2）本专利技术提供的方法能够快速且准确地顺利筛选出不影响转铁蛋白受体1功能的抗体，并能筛选出与TfR1的亲和力高于R3的抗体。
附图说明
[0021]图1是本专利技术实施例提供的验证R2阻断Tf和TfR1结合实验1的IC50曲线图。
[0022]图2是本专利技术实施例提供的验证R2阻断Tf和TfR1结合实验2的IC50曲线图。
[0023]图3是本专利技术实施例提供的用本专利技术的评估TfR1抗体血液安全性试剂盒对待测抗体安全性进行评估的结果曲线图。
具体实施方式
[0024]为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合
附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0025]本专利技术实施例提供一种临床前快速且准确进行TfR1抗体血液安全性评估的试剂盒，该试剂盒包括试剂R1和试剂X。
[0026]具体地，所述R1为用Biotin标记的Human Transferrin R/CD71抗原，可以为重组表达的抗原，也可以为纯化的天然来源的抗原，其在酶标板上的包被浓度为0.05~1 μg/mL。
[0027]具体地，所述试剂R2是AF2474抗体，其和Human Transferrin R/CD71抗原结合，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于进行TfR1抗体血液安全性评估的试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂X，其中，所述试剂R1为标记的Human Transferrin protein抗原，所述试剂X为R2或R3，所述试剂R2为AF2474，所述试剂R3为不和Tf识别相同抗原结合位点的TfR1抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含样品稀释液、底物显色液、终止液和/或浓缩洗涤液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为双组分TMB显色液。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为pH...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢亚非，
申请(专利权)人：迦进生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：