评估与蛋白偶联的核酸稳定性的方法及试剂盒技术

本发明专利技术适用于生物制药技术领域，提供了一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的方法，所述方法包括：a)将目标核酸偶联物与血浆混匀，孵育后储存；b)使用结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白对纯化载体进行包被；c)将包被后的纯化载体与待测样品进行共孵育，获得结合有待测样品的纯化载体；d)对目标待测样品进行分离，并通过每个峰的保留时间以及260 nm和280 nm的相对吸收比值，对目标待测样品稳定性进行分析。本发明专利技术还提供了一种用于对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的试剂盒。本发明专利技术相对于传统的核酸定量的PCR法，不需要引入外源探针来进行PCR扩增，可直接检测蛋白

【技术实现步骤摘要】
评估与蛋白偶联的核酸稳定性的方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物制药
，涉及一种用于评估与蛋白偶联的核酸稳定性的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]核酸偶联药物技术是近年基于抗体偶联药物（Antibody
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Drug Conjugates，ADC）、多肽偶联药物（Peptide
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Drug Conjugates，PDC）的上市和寡核苷酸疗法（Oligonucleotide Therapeutics）的成功发展起来的，具体是通过蛋白
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核酸共价偶联的方式，将抗体/多肽的组织靶向性与寡核苷酸疗法对基因的精准调控相结合，实现特定组织、器官或细胞中致病相关基因表达水平的上调、下调或者剪切调控、序列编辑等效果。与非偶联的核酸药物相比，核酸偶联药物能够有效改善药物的药代动力学特征，降低脱靶毒性，降低药物给药剂量等优势，具有很强的创新性和广阔的临床应用前景。
[0003]评价核酸药物的稳定性，是在核酸药物、核酸偶联药物的早期开发中都非常关注的核心问题之一。在核酸偶联药物中，决定靶向性的部分如抗体在循环系统中的降解相对缓慢，而决定药效的核酸部分则较容易发生降解。这和两类分子的生物学特性有关——蛋白作为生命活动执行者遍布全身，蛋白酶多分布在胞内的特殊细胞器比如溶酶体中发挥作用；核酸作为遗传信息的传递和储存者，正常的活动范围局限于细胞内，而核酸内切酶和外切酶大量存在于生物体内，作为对外源病原体的防御机制。
[0004]传统的抗体或多肽偶联药物的稳定性评估主要是通过质谱的方法，先利用免疫共沉淀的原理，在完成血浆共孵育后，通过识别相应抗原表位的免疫球蛋白（如单克隆抗体），将目标ADC/PDC从样品中捕获，然后进样进行质谱分析，得到偶联药物的完整性和药物抗体比（drug
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to
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antibody ratio，DAR）等信息。
[0005]但用以上方法对核酸偶联药物进行稳定性评估，却不太可行，因为在完成偶联物的捕获后，后续较难对完整的核酸蛋白偶联物分子进行质谱分析。其原因在于：首先，现有生物大分子质谱分析采取正离子模式，这会对核酸类带有高度负电荷的分子及其偶联物的离子化效率产生影响，使得难以基于质谱信号进行DAR值分析；其次，经过血浆孵育的样品，本身存在诸多降解产物，质谱能够较好地定义小分子的生物转化产物和对应的质谱信号，但较难对分子量较大（几kDa~十几kDa）且具有四碱基（A/U/C/G）重复结构的核酸分子进行谱图解析，因为核酸链在电离时的断裂方式排列组合的可能性非常之多，且可重复性较差，较难判断不同样品间相应的差异是稳定性实验过程中发生的还是质谱分析过程中引入的，故难以对核酸偶联物的稳定性进行准确表征。
[0006]传统的未偶联蛋白或多肽的寡核苷酸分子，其血浆稳定性测试的经典方法是先进行样品中的核酸组分提取，再采用Northen blot的方式，或者Stemloop
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qPCR的方式进行定量，前者操作步骤复杂且涉及同位素操作，后者需要引入外源的探针，并进行PCR扩增，检测的灵敏度也存在较大问题。若用此类方法来对核酸蛋白偶联物进行血浆稳定性测试，还需要克服核酸的提取问题：使用常规的核酸提取手段比如酚氯仿抽提，蛋白质部分会沉淀，这
会影响到目标核酸分子的回收；若采取蛋白酶切的方式进行处理，又会增加可变因素和样品制备的繁琐程度；即使采取了适当的样品前处理得到了重复性较好的结果，由于蛋白已经被去除，原始样品中偶联物DAR值和各组分占比的信息也因此丢失。
[0007]综上所述，核酸偶联药物作为刚刚兴起的一类治疗手段，目前尚无成熟的技术手段对其血浆稳定性进行表征和检测。当前亟需一种操作相对简便、结果更为准确的用于对核酸偶联药物的血浆稳定性进行定性、乃至定量分析的方法及试剂盒，以区别不同分子设计（核酸序列、修饰、连接子设计等）对核酸偶联药物稳定性的影响，满足核酸偶联药物早期研发的需求。

技术实现思路

[0008]本专利技术实施例的目的在于提供一种操作简便、结果准确的对核酸偶联药物的血浆稳定性进行分析的方法，该方法包括：a) 将目标核酸偶联物与血浆混匀；b) 使用结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白或抗体对纯化载体进行包被；c) 将包被后的纯化载体与待测样品进行共孵育，获得结合有待测样品的纯化载体；d) 通过离子交换色谱对目标待测样品进行分离，并通过每个峰的保留时间以及260 nm和280 nm的相对吸收比值，对目标待测样品稳定性进行分析。
[0009]优选地，所述核酸为天然或在特定位置经过化学修饰的、长度10
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200 nt的单链或者双链寡聚核苷酸。
[0010]进一步优选地，所述核酸为天然或经修饰的RNA序列。
[0011]优选地，所述目标核酸偶联物中的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、具有特定组织靶向性的长度不少于10个氨基酸的蛋白质、环状或线性的多肽。
[0012]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的试剂盒，该试剂盒包括：1)纯化载体、2)结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白、3)封闭缓冲液、4)清洗缓冲液、5)洗脱缓冲液、6)中和缓冲液、7)制剂缓冲液。
[0013]优选地，所述纯化载体是包被有链霉亲和素的磁珠、包被有Protein A/G的琼脂糖微球、或者含有NHS酯配基的聚合物微球。
[0014]优选地，所述结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白是单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段。
[0015]优选地，所述封闭缓冲液是含有离子和蛋白的中性缓冲液。
[0016]优选地，所述清洗缓冲液是含有离子和表面活性剂的中性缓冲液。
[0017]优选地，所述洗脱缓冲液是有生物相容性的酸性缓冲液；所述中和缓冲液是碱性缓冲液；所述制剂缓冲液是含有离子的弱酸性缓冲液。
[0018]由于核酸和蛋白具有不同的紫外吸收谱，因此能够通过经验摩尔消光系数，来推测样品中的蛋白质和核酸的相对比例；而由于核酸分子带有大量负电荷，一旦发生降解，则整个偶联物分子的等电点等理化特性也会有相应的变化。本专利技术利用以上两点，通过理化
手段结合离子交换色谱与核酸偶联物各组分在260nm和280nm的特征吸收特点对核酸偶联药物进行定性、乃至相对定量的分析，表征其稳定性的变化情况。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1）相对于传统的核酸定量的PCR法，本专利技术的方法不需要引入外源探针来进行PCR扩增，可以直接检测蛋白
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核酸偶联物信号，可以确定偶联物中不同DAR值偶联物的实际比例，步骤相对简单，数据更有参考价值；2）相比传统的液相
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质谱分析方法，本专利技术的方法受核酸序列和化学修饰的影响较小，结果重复性更好，能够更简便、更准确地表征核酸偶联物中核酸的降解情况。
附图说明
[0020]图1是本专利技术实施例提供的示出偶联物A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对与蛋白偶联的核酸稳定性进行分析的方法，所述方法包括：a) 将目标核酸偶联物与血浆混匀；b) 使用结合目标核酸偶联物中的蛋白的免疫球蛋白或抗体对纯化载体进行包被；c) 将包被后的纯化载体与待测样品进行共孵育，获得结合有待测样品的纯化载体；d) 通过离子交换色谱对目标待测样品进行分离，并通过每个峰的保留时间以及260 nm和280 nm的相对吸收比值，对目标待测样品稳定性进行分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为天然或在特定位置经过化学修饰的、长度10
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200 nt的单链或者双链寡聚核苷酸。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为天然或经修饰的RNA序列。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标核酸偶联物中的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、具有特定组织靶向性的长度不少于10个氨基酸的蛋白质、环状或线性的多肽。5.一种用于实施...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊，
申请(专利权)人：迦进生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：