一种提高RNA病毒检出率的方法技术

本发明专利技术涉及一种获得病毒RNA的方法，包括：去除第一核苷酸集合中的宿主rRNA，得到第二核苷酸集合；其中，所述第一核苷酸集合中包括宿主DNA、宿主rRNA和病原体RNA；所述第二核苷酸集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二核苷酸集合中的病原体RNA。本发明专利技术的技术方案流程简单，检测灵敏度高，RNA病原体的检测率高，对解决临床样本病毒载量低等问题，具有非常重要的参考意义。的参考意义。的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
一种提高RNA病毒检出率的方法


[0001]本专利技术涉及病原体检测方法，特别地涉及一种提高RNA病毒检出率的方法。

技术介绍

[0002]RNA病毒在感染性疾病发生和发展中发挥了重大作用，样本中RNA病毒和有转录活性微生物的鉴定，对于辅助感染性疾病的诊断具有重要的临床意义。
[0003]传统临床微生物实验室鉴定病毒的方法主要有分离培养、免疫荧光检测和PCR分子检测等，局限性非常明显。病毒的宏转录组测序可以全面、无偏倚的检出样本中的RNA病毒，还能及时发现传统方法无法检出的新型病原体及其突变，为辅助临床决策提供更精准的参考。现有的高通量测序技术，相较于传统病毒鉴定方法，具有周期短、成本低、对操作人员的技术要求一般等优势，被越来越多的临床科室所接受。
[0004]RNA病毒宏转录组的研究领域，临床样本宿主核酸量极高，可达到106个/mL的水平，对RNA病毒的准确检测造成干扰。现有的去除宿主核酸的常规方法，是通过化学方法或者差异性裂解宿主细胞，再使用核酸酶消化宿主DNA。但是，RNA病毒在样本中以游离病原或者核酸的形式存在，病毒相对其他微生物其结构简单，易裂解而释放出核酸，释放出的核酸进一步会被宿主及其他微生物的核酸酶降解。现有技术中的宿主核酸去除方法在去除宿主核酸的同时也损失了RNA病毒，造成检测结果的假阴性；并且，对RNA病毒的测序结果往往显示出较高的人源比例，影响RNA病毒的检出率。因此，现有测序方法对临床样本中RNA病毒的检测，一般不会进行宿主核酸的去除。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出了一种获得病毒RNA的方法，包括：去除第一核苷酸集合中的宿主rRNA，得到第二核苷酸集合；其中，所述第一核苷酸集合中包括宿主DNA、宿主rRNA和病原体RNA；所述第二核苷酸集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二核苷酸集合中的病原体RNA。
[0006]如上所述的的方法，进一步包括：去除第一核苷酸集合中的DNA，得到第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA以及病原体RNA；富集样本总核苷酸中的所述第一RNA集合，得到经富集的第一RNA集合；去除所述经富集的第一RNA集合中的宿主rRNA，得到第二RNA集合，所述第二RNA集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二RNA集合中的病原体RNA。
[0007]如上所述的方法，其中，所述第二核苷酸集合中包括第二RNA集合。
[0008]如上2所述的方法，其中富集所述第一RNA集合的方法包括：使用第一磁珠富集所述第一RNA集合，所述第一磁珠的使用量为样本体积的1.6倍
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2.0倍，优选为1.8倍。
[0009]如上所述的方法，进一步包括：在样本中加入rRNA探针，所述rRNA探针经配置以特异性地结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA而不结合病原体RNA；以及从样本中去除所述rRNA探针与所述宿主rRNA结合的复合物。
[0010]如上所述的方法，进一步包括：在样本中加入RNA酶，所述RNA酶消化与rRNA探针结合的宿主rRNA，而不消化病原体RNA。
[0011]如上所述的方法，纯化病原体RNA的方法包括：使用第二磁珠富集残余DNA和第二核苷酸集合或第二RNA集合中除病原体RNA以外的残余RNA；所述磁珠的使用量为样本体积的2.0倍
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2.4倍，优选为2.2倍。
[0012]如上所述的方法，其中富集样本中的病原体RNA的方法包括：使用第三磁珠富集病原体RNA，所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍
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2.4倍，优选为2.2倍。
[0013]如上所述的方法，所述样本为肺泡灌洗液、脑脊液、血液、尿液、粪便、呼吸道样本、胸水、腹水、心包液、呕吐物、脓肿组织。
[0014]如上所述的方法，所述病原体为以下RNA病毒中的一个或者多个：人正肺病毒、鼻病毒A、人偏肺病毒(hMPV)、GBV
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C、人呼吸道病毒3、人副流感病毒2型、甲型流感病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、艾滋病病毒、乙型脑炎病毒，乙型流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒、噬菌体、新型冠状病毒(COVID
‑
19)。
[0015]一种提高样本中RNA病毒检出率的方法，包括：提取样本核苷酸，得到第一核苷酸集合；其中所述第一核苷酸集合中包括：宿主DNA，宿主rRNA，以及病原体RNA；使用如权利要求1
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10任一所述的获得病毒RNA的方法纯化病源体RNA；反转录病原体RNA，获得双链病原体cDNA；构建所述病原体cDNA文库；对所述cDNA文库测序。
[0016]如上所述的方法，进一步包括：纯化所述cDNA。
[0017]如上所述的方法，通过电泳法纯化所述cDNA，和/或加入第三磁珠纯化所述cDNA；所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍
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2.4倍，优选为2.2倍。
[0018]如上所述的方法，所述cDNA文库中，双链病原体cDNA长度为300
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700bp。
[0019]一种纯化样本总核苷酸中病毒RNA的试剂盒，包括：DNA酶，其经配置以去除第一核苷酸集合中的DNA，获得第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA，以及病原体RNA；或者其经配置以去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的DNA；rRNA探针，其经配置以结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA，而不结合病原体RNA；RNA酶，其经配置以去除与rRNA探针结合的宿主rRNA而不去除病原体RNA；RNA磁珠，其经配置以富集所述第一RNA集合和/或反向富集去除宿主rRNA后的病源体RNA；所述RNA磁珠包括：第一磁珠和/或第二磁珠。
[0020]一种提高样本中RNA病毒检出率的试剂盒，包括：DNA酶，其经配置以去除第一核苷酸集合中的DNA，获得第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA，以及病原体RNA；或者其经配置以去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的DNA；rRNA探针，其经配置以结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA，而不结合病原体RNA；RNA酶，其经配置以去除与rRNA探针结合的宿主rRNA而不去除病原体RNA；RNA磁珠，其经配置以富集所述第一RNA集合和/或反向富集去除宿主rRNA后的病源体RNA；所述RNA磁珠包括：第一磁珠和/或第二磁珠。
[0021]如上任一所述的获得病毒RNA的方法，或者如上所述的提高样本中RNA病毒检出率的方法在检测样本中RNA病原体方面的应用。
[0022]本专利技术与现有检测方法相比较，其优点在于：
[0023]适用但不限于人和动物脑脊液、血液、肺泡灌洗液、脓肿组织等样本宏转录组检测；
[0024]经过优化后的宿主核酸去除流程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得病毒RNA的方法，包括：去除第一核苷酸集合中的宿主rRNA，得到第二核苷酸集合；其中，所述第一核苷酸集合中包括宿主DNA、宿主rRNA和病原体RNA；所述第二核苷酸集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二核苷酸集合中的病原体RNA。2.根据权利要求1所述的的方法，进一步包括：去除第一核苷酸集合中的DNA，得到第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA以及病原体RNA；富集样本总核苷酸中的所述第一RNA集合，得到经富集的第一RNA集合；去除所述经富集的第一RNA集合中的宿主rRNA，得到第二RNA集合，所述第二RNA集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二RNA集合中的病原体RNA。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二核苷酸集合中包括第二RNA集合。4.根据权利要求2所述的方法，其中富集所述第一RNA集合的方法包括：使用第一磁珠富集所述第一RNA集合，所述第一磁珠的使用量为样本体积的1.6倍
‑
2.0倍，优选为1.8倍。5.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：在样本中加入rRNA探针，所述rRNA探针经配置以特异性地结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA而不结合病原体RNA；以及从样本中去除所述rRNA探针与所述宿主rRNA结合的复合物。6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括：在样本中加入RNA酶，所述RNA酶消化与rRNA探针结合的宿主rRNA，而不消化病原体RNA。7.根据权利要求1或2所述的方法，纯化病原体RNA的方法包括：使用第二磁珠富集残余DNA和第二核苷酸集合或第二RNA集合中除病原体RNA以外的残余RNA；所述第二磁珠的使用量为样本体积的2.0倍
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2.4倍，优选为2.2倍。8.根据权利要求7所述的方法，其中富集样本中的病原体RNA的方法包括：使用第三磁珠富集病原体RNA，所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍
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2.4倍，优选为2.2倍。9.根据权利要求1所述的方法，所述样本为肺泡灌洗液、脑脊液、血液、尿液、粪便、呼吸道样本、胸水、腹水、心包液、呕吐物、脓肿组织。10.根据权利要求1所述的方法，所述病原体为以下RNA病毒中的一个或者多个：人正肺病毒、鼻病毒A、人偏肺病毒(hMPV)、GBV
‑
C、人呼吸道病毒3、人副流感病毒2型、甲型流感病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、艾滋病病毒、乙型脑炎病毒，乙型流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、SARS病毒、MERS病毒、...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏少华，陈凤，庞锦，崔延伟，
申请(专利权)人：广州欧蒙未一医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：