单细胞DNA和RNA的同时扩增制造技术

本发明专利技术提供了一种从单细胞或细胞核同时鉴定多种目标生物分子类型的方法。该方法使用基于分子生物学的标记和扩增来自同一细胞的DNA和RNA，在单个容器反应中进行，生成可测序的扩增的核酸文库。细胞中任何DNA或RNA形式的核酸都可以使用相同的方法进行标记和共扩增，包括附着在其他生物分子上的DNA或RNA标签。包括附着在其他生物分子上的DNA或RNA标签。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单细胞DNA和RNA的同时扩增
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年10月19日提交的美国临时申请美国系列号为63/093,368的权益，该申请通过引用将其全部纳入本文，包括任何表格、图片或附图。

技术介绍

[0003]单细胞基因组学已成为用于解剖由具有多种功能的细胞组成的多细胞生物和组织的主要技术1‑4。这种方法的能力已在下列几项细胞图谱的研究中得到了证实：发现了新的细胞类型，进一步阐明了新的机制；已经揭示了与疾病发生或进展相关的复杂细胞相互作用和转变；跨物种分析揭示了进化过程5‑7。单细胞技术在癌症研究中的应用尤为重要。耐药或免疫逃逸的潜在调控机制是难以捉摸且复杂的，肿瘤细胞异质性肿瘤是导致这种复杂性的主要因素，这使得用批量技术来分析这些机制尤其具有挑战性8‑
10
。单细胞技术极大地增强了我们对肿瘤异质性的理解，并且加速了机制的发现。在表型水平上，单细胞RNA
‑
seq(scRNA
‑
seq)已被用于揭示耐药黑色素瘤亚群，并表征成胶质细胞瘤中的癌干细胞亚群
7,11
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。scRNA
‑
seq还使人们能够更全面地了解包括胶质瘤和结直肠癌在内的许多癌症中的肿瘤微环境(TME)的表型
15
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。在基因型水平上，基因组不稳定性促使癌症发生、发展、复发和转移8。通过单细胞全基因组测序(scWGS)，可以解析肿瘤的克隆结构，并且基于拷贝数畸变(CNAs)的进化分析可以揭示肿瘤进展
20,21
。
[0004]显然，肿瘤的基因组和转录组异质性都导致了这种疾病，了解两者在癌症研究中的重要性至关重要。已经开发了几种在同一细胞中同时探询DNA和RNA的单细胞方法(scWGS RNAseq)
22
‑
26
。然而，这些第一代scWGS RNAseq方法自其专利技术以来尚未被广泛应用，主要是因为它们需要物理分离DNA和RNA，通常通过细胞核与细胞质的物理分离来实现，有时通过基于polyT珠的捕捞从细胞的其余部分物理分离聚腺苷酸化RNA。这些分离技术是劳动密集型的，技术要求高，耗时长，需要训练有素的实验技术人员，或者需要特殊的微流体装置。此外，它们不适用于冷冻样本，因为从冷冻样本中无法获得完整的单细胞悬液。因此，现有的scWGS RNAseq方法不能应用于绝大多数原始生物库肿瘤样本。总之，这些限制使得第一代scWGS RNAseq方法不易于应用。
[0005]因此，仍然需要对来自单细胞的DNA编码和RNA编码的信息进行共谱分析的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术涉及一种新的单细胞DNA和RNA共扩增方法scONE
‑
seq，其能够在一个容器反应中对来自同一单细胞或细胞核的转录组和基因组进行共谱分析。在某些实施方案中，本专利技术涉及一种条形码策略，该策略在单细胞DNA/RNA扩增过程中向每种类型的核酸引入6个碱基长的DNA特异性条形码和RNA特异性条形码，同时还包括独特的分子标识符(UMI)
27
‑
29
。因此，DNA和RNA读长可以通过共享引物区域一起扩增，但随后在测序后，通过它们各自的特异性条形码信息在计算机上(in
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silico)进行区分。与第一代scWGSRNAseq方法相比，scONE
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seq具有几个优点：它具有简化的文库构建工作流程；它与标准生物学工作流程兼
容，例如荧光活化细胞分选(FACS)；作为一锅(即，一个容器或一个管)反应，可以使用液体处理机器人轻松地扩大其产量；最重要的是，scONE
‑
seq不需要物理分离DNA和RNA，因此适用于包括单细胞核在内的多种样本类型。在某些实施方案中，难以分离成单细胞悬液的冷冻临床样本和细胞类型(其对于scDR seq方法是难以处理的)可以使用scONE
‑
seq进行分析。
[0007]该方法是一种DNA/RNA条形码策略，在单细胞DNA/RNA共扩增之前，分别用不同的核酸条形码给DNA和RNA加标签。还可以添加扩增接头，其用于使用同一引物组共同扩增DNA和逆转录cDNA，生成测序文库。测序后，DNA和RNA读长可以通过条形码的解复用进行计算区分。
[0008]本专利技术的方法可用于任何类型的细胞。本专利技术的方法可应用于单细胞的全基因组和总转录组的共谱分析。这些方法对于研究癌症等疾病特别有用，在这些疾病中，基因组和转录组反映了疾病进展的不同方面。这些方法也可用于研究细胞内的病毒活性，因为受感染的细胞除了含有内源性基因组和转录组外，还含有病毒DNA和RNA。本方法可进一步用于鉴定细菌及其与噬菌体的相互作用。在某些实施方案中，还可以使用本主题的方法来筛选药物并发现新的药物或药物功能。在某些实施方案中，所述方法可以与微流体装置一起使用。
附图说明
[0009]专利或申请文件包含至少一幅彩色绘图。本专利或专利申请出版物的副本，连同彩色图纸，将由专利局在收到要求并支付必要费用后提供。
[0010]图1A
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1K。scONE
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seq概述：原理图和基准。图1A，scONE
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seq的流程。通过添加分别带有定制接头和RT引物的Tn5添加DNA和RNA条形码。Read2 Illumina测序引物包含在该预扩增过程中。Read1
‑
Illumina测序引物在随后的文库构建步骤中添加第二Tn5标签化的定制接头。图1B，scONE
‑
seq(n＝86，HCT116细胞)和Smart
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seq2(n＝94，HCT16细胞)的基因检测灵敏度，下采样至相似的测序深度(20万个比对读长)(P＜2x10
‑
16
，t检验)。图中显示了超过1个计数检测到的基因数量。图1C，scONE
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seq(n＝86)和Smart
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seq2(n＝94)的基因体覆盖度。细胞
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细胞变化以误差区域显示。图1D
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1G，scONE
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seq(RNA对照，DNA+RNA组)和Smart
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seq2的模拟样本的准确度。皮尔逊相关性由对数转换TPM值计算得出。图1H，批量和scONE
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seq单细胞数据的洛伦兹曲线。所覆盖基因组的百分位数是相对于累计读长分数的对比图。完美的覆盖度均匀性得到斜率为1的直线。图1I
‑
K，在基因组上具有归一化计数的点图和对应估计的整数拷贝数的实线图。扩增区域用红色突出显示；缺失区域用浅蓝色突出显示。来自批量HCT116全基因组测序(图1I)、HCT116 scONE
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seq伪批量数据(图1F＝J，n＝86)和单细胞HCT116 scONE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从样本中扩增至少一个RNA序列和至少一个DNA序列的方法，包括：a)提供包含至少一个RNA序列和至少一个DNA序列的样本；b)任选地，从样本中纯化RNA序列和DNA序列；c)通过使所述DNA序列与装载有第一DNA寡核苷酸接头的转座酶接触将所述DNA片段化，其中所述转座酶使所述DNA序列片段化，并将所述第一DNA寡核苷酸接头与所述DNA序列连接，以产生经标记的片段化DNA序列(fDNA)，其中各DNA寡核苷酸接头包括DNA特异性条形码、共享扩增引物序列和独特的分子标识符(UMI)；d)使第二DNA寡核苷酸接头与所述RNA序列退火，其中所述第二DNA核苷酸接头包括RNA特异性条形码、所述共享扩增引物序列、退火序列和独特的分子标识符(UMI)；e)将逆转录酶添加到与所述DNA寡核苷酸接头退火的所述RNA序列以合成cDNA序列；f)给所述cDNA序列添加poly C尾；g)使第三DNA寡核苷酸接头与步骤f)得到的带poly C尾的cDNA退火，其中所述第三DNA寡核苷酸接头包括5
’
polyG序列、RNA特异性条形码、所述共享扩增引物序列、退火序列和独特的分子标识符；h)合成与步骤g)的所述cDNA序列互补的DNA序列以产生双链cDNA；和i)使用共享引物序列同时扩增双链cDNA序列和fDNA序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本包括单细胞和/或细胞核。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述单细胞是细菌细胞、古菌细胞或真核细胞。4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)进一步包括裂解细胞以从细胞中分离RNA序列和DNA序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)进一步包括提供与样本中的RNA序列和/或DNA序列退火的多个接头。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述多个接头在约2至约100之间、约2至5之间、或约4。7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤d)进一步包括提供至少2个或至少3个与样本中的两个或更多个RNA序列退火的接头。8.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴若昊，于雷，
申请(专利权)人：香港科技大学，
类型：发明
国别省市：