一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途技术

本申请提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途，以一株贝莱斯芽孢杆菌FS001的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增xlyB(BSFS001GM003346)基因，将该基因与pET

【技术实现步骤摘要】
一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途


[0001]本申请涉及生物工程
，具体而言，涉及一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途。

技术介绍

[0002]芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，其细胞壁是一层厚而致密的肽聚糖和磷壁酸组成因此具有极强抗逆作用、在高温、酸碱等极性环境下亦可生存。因此，现有技术中，通过使用抗生素杀死芽孢杆菌时，容易出现病菌对抗生素产生抗性等问题。在细菌裂解酶的特异性和高活性的特征下使用细菌裂解酶对芽孢杆菌进行裂解杀死的研究越来越备受关注。

技术实现思路

[0003]本申请实施例的目的在于提供一种特异性芽孢杆菌裂解酶及其制备方法、用途，其能够为细菌程序性死亡的探究提供了分子基础并且也为开发利用高效的水解芽孢杆菌裂解酶提供理论基础。
[0004]根据本申请的第一方面，提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶，所述裂解酶为N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶，所述裂解酶基于贝莱斯芽孢杆菌FS001基因组测序数据分析获得。
[0005]根据本申请的第二方面，还提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶的制备方法，包括以下步骤：
[0006]S1、设计并合成扩增N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶的引物，包括上游引物及下游引物。
[0007]所述上游引物的序列为：CGGGATCCGGTGGGGATTGAAGTGAAAAA。
[0008]所述下游引物的序列为：CCGCTCGAGCAGTTTTTCTTCAATTTTCG。
[0009]S2、基于所述上游引物以及所述下游引物，并以贝莱斯芽孢杆菌FS001基因组为模板进行扩增，以获取目的基因片段。
[0010]S3、将所述目的基因片段与质粒连接，完成重组质粒的构建；所述重组质粒转化进入大肠杆菌进行表达。
[0011]S4、纯化后获取N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶。
[0012]在一种可实施的方案中，在步骤S2中，扩增的条件至少包括：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，共设30个循环。
[0013]在一种可实施的方案中，在步骤S3之后，筛选含有N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。
[0014]在一种可实施的方案中，在步骤S4中，所述纯化至少包：使用蛋白纯化系统进行蛋白纯化。
[0015]根据本申请的第三方面，还提供了一种裂解酶的用途，使用第一方面提供的裂解酶对芽孢杆菌进行特异性裂解。
[0016]在一种可实施的方案中，所述芽孢杆菌至少包括枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、阿氏芽孢杆菌。
[0017]在一种可实施的方案中，所述特异性裂解的反应适宜条件至少包括：pH为6.5
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7.5，温度为30
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37℃。
[0018]在一种可实施的方案中，所述特异性裂解的反应适宜条件包括：pH为6.5，温度为37℃。
[0019]在一种可实施的方案中，通过吸光度测定确定所述裂解酶对芽孢杆菌进行裂解的效果。
[0020]与现有技术相比，本申请的有益效果为：
[0021]在本申请的技术方案中，根据本申请提供的裂解酶具有特异性和高活性，对病原菌特异性强且不干扰正常菌群；可杀死定殖在粘膜表面的病原菌；细菌对该裂解酶的耐药性几率低。可水解多种芽孢杆菌的细胞壁，能够高效裂解芽孢杆菌。对于抑制芽孢杆菌生长及生物医药和食品生产方面有很大的应用前景。
附图说明
[0022]图1是本专利技术实施例的裂解酶制备方法中，基因聚合酶链式反应结果电泳图。
[0023]图2是本专利技术实施例的裂解酶制备方法中，重组载体的构建图。
[0024]图3是本专利技术实施例的裂解酶制备方法中，纯化后酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0025]图4是本专利技术实施例的裂解酶，在不同pH值条件下水解枯草芽孢杆菌效果比对示意图；
[0026]图5是本专利技术实施例的裂解酶，在37℃、pH值为6.5条件下水解芽孢杆菌效果示意图；
[0027]图6是本专利技术实施例的裂解酶，水解枯草芽孢杆菌前后镜检照片。
具体实施方式
[0028]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。这些实施方式仅用于说明本专利技术，而并非对本专利技术的限制。
[0029]根据本申请的第一方面，首先提供一种特异性芽孢杆菌裂解酶(WP_015417280.1，其蛋白质分子量为35.11KDa)，所述裂解酶为N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶，命名为xlyB。所述裂解酶基于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)FS001基因组测序数据分析获得。
[0030]生物保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号No：17946，保藏日期2019.06.17。
[0031]根据本申请的第二方面，还提供了一种特异性芽孢杆菌裂解酶的制备方法。
[0032]需要说明的是，本实施例提供的制备方法中涉及的生物材料包括：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FS001为本实验室筛选，大肠杆菌E.coliJM109、大肠杆菌E.coilBL21和表达载体pET
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23b；细菌基因组DNA提取试剂盒购自BioTeke；DNA聚合酶购自上海生工公司；限制性内切酶BamHI、XhoI和T4连接酶购自Takara公司；每升LB培养基含蛋
白胨10g、酵母抽提物5g、NaCl10g；结合缓冲液包括300mMNaCl、50mM磷酸氢二钠、10mM咪唑，结合缓冲液的pH为7.4；漂洗缓冲液包括300mMNaCl、50mM磷酸氢二钠、20mM咪唑，漂洗缓冲液的pH为7.4；洗脱缓冲液包括300mMNaCl、50mM磷酸氢二钠、500mM咪唑，洗脱缓冲液的pH为7.4；磷酸缓冲液(记为1
×
PBS缓冲液)包括10mM磷酸盐，1xPBS缓冲液的pH为7.2
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7.4；氨苄青霉素和溶菌酶购自上海生工。本实施例中使用的含氨苄青霉素的LB培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/mL。
[0033]所述制备方法，包括以下步骤：
[0034]S1、设计并合成扩增去除终止密码子编码序列的N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶基因xlyB的引物，包括上游引物及下游引物。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性芽孢杆菌裂解酶，其特征在于，所述裂解酶为N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶，所述裂解酶基于贝莱斯芽孢杆菌FS001基因组测序数据分析获得；生物保藏编号为CGMCCNo.17946。2.一种特异性芽孢杆菌裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、设计并合成扩增N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶的引物，包1括上游引物及下游引物；所述上游引物的序列为：CGGGATCCGGTGGGGATTGAAGTGAAAAA；所述下游引物的序列为：CCGCTCGAGCAGTTTTTCTTCAATTTTCG；S2、基于所述上游引物以及所述下游引物，并以贝莱斯芽孢杆菌FS001基因组为模板进行扩增，以获取目的基因片段；S3、将所述目的基因片段与质粒连接，完成重组质粒的构建；所述重组质粒转化进入大肠杆菌进行表达；S4、纯化后获取N
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乙酰胞壁酰
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L
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丙氨酸
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酰胺酶。3.根据权利要求1所述的裂解酶的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁小波，王振宇，刘贻坦，冯应山，唐若诗，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：