一种生物样品中青藤碱的定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种生物样品中青藤碱的定量分析方法，属于原料药的检测分析技术领域，包括1)供试品的制备，2)空白样品的制备，3)内标工作液的制备，4)标准曲线溶液的制备，5)液相条件，6)质谱条件，7)检测分析七个步骤；采用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种生物样品中青藤碱的定量分析方法


[0001]本专利技术属于原料药的检测分析
，具体涉及一种生物样品中青藤碱的定量分析方法。

技术介绍

[0002]青藤碱是从中药青风藤中提取的单体成分，青藤碱制剂有片剂和注射剂等多种剂型，具有祛风除湿、活血通络、利水消肿的功效。临床上用于治疗肌肉酸痛、关节肿胀、疼痛，屈伸不利，麻木僵硬及风湿与类风湿性关节炎具有上述证候者，亦用于慢性肾炎(普通型为主)属湿邪瘀阻证者。青藤碱其结构式如图1所示：
[0003]目前，对生物样品中青藤碱的检测方法多采用高效液相色谱法[张斯汉，周远大，何海霞.青藤碱在家兔体内的药代动力学研究[J].重庆医科大学学报，2008(7)：868
‑
870.]，对于血浆、尿液等生物样品数量需要数百微升，样品处理方法采用有机溶剂萃取，存在灵敏度低，样品需求大，处理操作复杂等情况，影响药代动力学实验结果的准确性。
[0004]为了获得青藤碱的准确临床药代数据，本专利技术研究出一种生物样品中青藤碱的定量分析方法，建立了液相色谱
‑
质谱联用法检测人体血浆以及尿液中青藤碱的浓度。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种生物样品中青藤碱的定量分析方法，采用液相色谱
‑
质谱联用法检测人体血浆以及尿液中青藤碱的浓度，选用右啡烷酒石酸酯作为内标，能够减少生物样品取样量，简化样品处理操作，速度快，分析时间短，选择性好，灵敏度高，检测限低，减少污染，保证生物样品中青藤碱定量分析结果的准确、可靠。
[0006]为实现以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0007]一种生物样品中青藤碱的定量分析方法，该方法包括以下步骤：
[0008]1)供试品的制备：取人血浆样或尿液样品20
‑
60μL置于1.5μL离心管中，加入100
‑
150μL甲醇沉淀蛋白，在1000
‑
2000rpm振摇10
‑
20min后，再在10000
‑
15000rpm离心5
‑
15min，然后取上清液20
‑
60μL于进样瓶，作为供试品溶液备用；
[0009]2)空白样品的制备：取空白人血浆或空白尿液样品20
‑
60μL置于1.5μL离心管中，加入100
‑
150μL甲醇沉淀蛋白，在1000
‑
2000rpm振摇10
‑
20min后，再在10000
‑
15000rpm离心5
‑
15min，取上清液20
‑
60μL于进样瓶，作为空白溶液备用；
[0010]3)内标工作液的制备：精密称取右啡烷酒石酸酯内标物于1.5mL离心管中，加入甲醇溶解，配成浓度为2
‑
6mM的内标储备液，然后用甲醇将内标储备液稀释至浓度为0.2
‑
0.6μM的内标工作液备用；
[0011]4)标准曲线溶液的制备：精密称取盐酸青藤碱对照品于1.5mL离心管中，加入甲醇溶解，配成浓度为2
‑
6mM的青藤碱储备液，存于
‑
70℃冰箱中保存备用；再将青藤碱储备液用乙腈稀释成不同浓度的标准曲线工作液，分别将5μL标准曲线工作液加入20
‑
60μL空白人血
浆，加入100
‑
150μL甲醇，沉淀蛋白，在1000
‑
2000rpm振摇10
‑
20min后，再在10000
‑
15000rpm离心5
‑
15min，然后取上清液20
‑
60μL于进样瓶，作为标准曲线溶液备用；
[0012]5)液相条件：
[0013]仪器：Agilent1290Infinity液相色谱仪；
[0014]色谱柱：FortisDiphenyl柱(50mm
×
2.1mmID；3μM)；柱温：室温；
[0015]进样量：5μL
[0016]流动相A：0.04
‰
的甲酸水溶液；流动相B：0.04
‰
的甲酸甲醇溶液；
[0017]6)质谱条件：
[0018]仪器：API400Qtrap质谱仪；
[0019]离子源：ESI；
[0020]离子模式：正离子；
[0021]扫描方式：MRM；
[0022]源电压：5000V；
[0023]Gas1(N2)：50psi；Gas2(N2)：60psi；CurtainGas(N2)：20psi；CADGas(N2)：Medium；TEM：550℃；
[0024]7)检检测分析：精密吸取步骤1制得的人血浆供试品或尿液供试品，步骤2制得的空白人血浆或了空白尿液样品、步骤3制得的内标工作液和步骤4制得的标准曲线溶液各5μL，分别注入液相色谱质谱联用仪进行检测，标准曲线以青藤碱浓度为横坐标，青藤碱与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算(权重系数为1/X2)，求得的直线回归方程即为标准曲线；供试青藤碱浓度的计算是将青藤碱与内标物色谱峰面积比代入回归方程获得。
[0025]进一步地，所述步骤1、步骤2和步骤4中沉淀蛋白加入的甲醇含有50nM内标工作液。
[0026]进一步地，所述步骤3中右啡烷酒石酸酯的Mw为407.5，纯度>99％。
[0027]进一步地，所述步骤4中盐酸青藤碱的Mw为365.85，纯度为96.7％。
[0028]进一步地，所述步骤5中液相色谱仪的洗脱程序如下：
[0029]时间(min)0.04
‰
甲酸水(％)0.04
‰
甲酸甲醇(％)0982198228020555455.15956.55956.69828982
[0030]进一步地，所述步骤6中质谱仪检测离子及化合物参数如下：
[0031]化合物Q1(m/z)Q3(m/z)DP(V)CE(V)CXP(V)青藤碱330.2181.1100458IS258.1175.0
‑
76
‑
5310
[0032]本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术研究的质联用分析人体血浆中的青藤碱的分析方法可用于准确定量检测在4.12
‑
3000nM浓度的血浆样品和12.3
‑
6000nM范围内的尿样浓度，人体尿样超标曲样品采用处理后的空白样品溶液进行40倍内稀释；该方法具有较好的准确度、精密度、选择性、基质；效应、回收率。
附图说明
[0033]图1为青藤碱化学结构图；
[0034]图2为右啡烷酒石酸酯化学结构图；
[0035]图3为实施例1中空白血浆样品色谱图；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物样品中青藤碱的定量分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1)供试品的制备：取人血浆样或尿液样品20
‑
60μL置于1.5μL离心管中，加入100
‑
150μL甲醇沉淀蛋白，在1000
‑
2000rpm振摇10
‑
20min后，再在10000
‑
15000rpm离心5
‑
15min，然后取上清液20
‑
60μL于进样瓶，作为供试品溶液备用；2)空白样品的制备：取空白人血浆或空白尿液样品20
‑
60μL置于1.5μL离心管中，加入100
‑
150μL甲醇沉淀蛋白，在1000
‑
2000rpm振摇10
‑
20min后，再在10000
‑
15000rpm离心5
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15min，取上清液20
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60μL于进样瓶，作为空白溶液备用；3)内标工作液的制备：精密称取右啡烷酒石酸酯内标物于1.5mL离心管中，加入甲醇溶解，配成浓度为2
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6mM的内标储备液，然后用甲醇将内标储备液稀释至浓度为0.2
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0.6μM的内标工作液备用；4)标准曲线溶液的制备：精密称取盐酸青藤碱对照品于1.5mL离心管中，加入甲醇溶解，配成浓度为2
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6mM的青藤碱储备液，存于
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70℃冰箱中保存备用；再将青藤碱储备液用乙腈稀释成不同浓度的标准曲线工作液，分别将5μL标准曲线工作液加入20
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60μL空白人血浆，加入100
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150μL甲醇，沉淀蛋白，在1000
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2000rpm振摇10
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20min后，再在10000
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15000rpm离心5
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15min，然后取上清液20
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60μL于进样瓶，作为标准曲线溶液备用；5)液相条件：仪器：Agilent 1290Infinity液相色谱仪...

【专利技术属性】
技术研发人员：李川，许李，杨军令，彭晓珊，王秋月，滕健，朱永波，黄宇明，吴飞驰，周华，刘良，
申请(专利权)人：湖南正清制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：