分离基质制造技术

本发明专利技术涉及碱稳定的突变Fc

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离基质


[0001]本专利技术涉及亲和色谱的领域，且更特别地涉及蛋白A的突变的免疫球蛋白
‑
结合结构域，其可用于免疫球蛋白的亲和色谱。本专利技术还涉及所述突变的结构域的多聚体和涉及含有突变的结构域或多聚体的分离基质。
[0002]专利技术背景
[0003]免疫球蛋白代表全世界生产或开发中的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及由此其价值已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的mAb生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。
[0004]亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子，例如单克隆或多克隆抗体的纯化中的关键步骤之一而使用。一类特别感兴趣的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白，这样的相互作用是独立于抗体的抗原
‑
结合特异性的。这样的试剂可广泛用来从不同的样品(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养来源的原料)亲和色谱回收免疫球蛋白。这样的蛋白的例子是葡萄球菌蛋白A，其含有能够结合来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc以及Fab(通过V
H
3结构域)部分的结构域。这些结构域通常被称为E
‑
、D
‑
、A
‑
、B
‑
和C
‑
结构域(SEQ ID NO:1
‑
5)。
[0005]基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的试剂由于它们的高亲和性和选择性，已发现广泛用于生物
，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。目前，基于SpA的亲和介质很可能是最广泛使用的从不同的样品(包括工业细胞培养上清液)分离单克隆抗体及其片段的亲和介质。因此，包含蛋白A
‑
配体的各种基质是可市售获得的，例如，以天然蛋白A的形式(例如Protein A SEPHAROSE
TM
,Cytiva,Uppsala,Sweden)，并且还包含重组蛋白A(例如rProtein A
‑
SEPHAROSE
TM
,Cytiva)。更特别地，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操纵旨在促进其附接于支持物和提高配体的生产力。
[0006]这些应用，像其它亲和色谱应用一样，需要综合考虑污染物的确切去除。这样的污染物可以例如是在色谱程序中吸附在固定相或基质上的未洗脱的分子，例如非希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质去除这样的污染物通常在第一次洗脱所需产物后进行，以在随后使用之前使基质再生。这样的去除通常涉及称为原位清洁(CIP)的程序，其中使用能够从固定相洗脱污染物的试剂。经常使用的一类这样的试剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是NaOH，且其浓度可在从0.1直至例如1M的范围内，这取决于污染的程度和性质。这个策略与基质暴露于具有高于13的pH值的溶液有关。对于许多含有蛋白质亲和配体的亲和色谱基质，这样的碱性环境是非常苛刻的条件且由于配体对所涉及的高pH的不稳定性，因此导致能力下降。
[0007]因此，广泛的研究已经集中于工程改造的蛋白配体的开发，所述配体表现出耐碱性pH值的改进能力。例如，G
ü
lich等(Susanne G
ü
lich,Martin Linhult,Nygren,Mathias Uhl
é
n,Sophia Hober,Journal of Biotechnology 80(2000),169
‑
178)提出蛋白工程改造以改进链球菌白蛋白
‑
结合结构域(ABD)在碱性环境中的稳定性特性。G
ü
lich等创建了一种ABD突变体，其中所有4个天冬酰胺残基已被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残
基)和赖氨酸(1个残基)替代。此外，G
ü
lich等报告他们的突变体表现出一种类似于天然蛋白的靶蛋白结合行为，并且含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露于碱性条件后显示出比使用亲本的非
‑
工程改造的配体制备的柱更高的结合能力。因此，从中得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被替代，而对结构和功能无任何显著的影响。
[0008]最近的工作显示，也可对蛋白A(SpA)进行修改以实现类似的特性。美国专利7,834,158，其通过引用以其整体结合到本文中，公开了当至少一个天冬酰胺残基被突变为并非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予在至多约13
‑
14的pH值时，与亲本SpA，例如SpA的B
‑
结构域，或蛋白Z(SEQ ID NO:6)(一种源自SpA的B
‑
结构域的合成构建体)(US 5,143,844，通过引用以其整体并入)相比，增加的化学稳定性。作者表明当这些突变的蛋白用作亲和配体时，分离基质如所期望的可更好地耐受使用碱性试剂的清洁程序。这特别适用于具有突变N3A,N6D,N23T的蛋白Z(SEQ ID NO:7，本文称为Zvar)，如US 8,198,404中所公开，其通过引用以其整体并入本文。为增加碱稳定性的目的，蛋白A结构域的另外的突变也已经公开于US 8,329,860、JP 2006304633A、US 8,674,073、US 10,072,050、US 9,403,883、US 9,051,375、US 9,051,375、US 9,683,013、US 2019/048046和US 10,703,774中，其全部通过引用以其整体结合到本文中。然而，仍然需要具有较高的碱稳定性的突变体，其允许在分离基质由于能力损失而不得不丢弃之前用NaOH的较高数量的清洁循环。
[0009]因此，本领域仍有获得含有蛋白配体的分离基质的需要，所述蛋白配体具有对碱性清洁程序的进一步改进的稳定性。对这样的分离基质也存在需要，所述分离基质具有改进的结合能力，以允许治疗性抗体的经济有效纯化。
[0010]专利技术简述
[0011]本专利技术的一个方面是提供具有改进的碱稳定性的多肽。这用Fc
‑
结合多肽实现，所述多肽包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9定义，或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95％，例如至少98％同一性的氨基酸序列。或者，所述多肽包含由SEQ ID NO:11定义，或与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的序列。
[0012]X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3SKAILAEAKK LNDAQ(SEQ ID NO:11)
[0013]其中彼此单独地：
[0014]X1＝A或W
[0015]X2＝E或R
[0016]X3＝V或Q，
[0017]前提条件是当X1是A时，X2＝R，并且当X2＝E时，X1＝W。
[0018]一个优点是碱稳定性相对于亲本多肽得到改进，并本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种Fc
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结合多肽，其包含由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9定义，或与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少95％、例如至少98％同一性的氨基酸序列。2.一种Fc
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结合多肽，其包含由SEQ ID NO:11定义，或与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的序列：X1Q X2AFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSX3SKAILAEAKK LNDAQ(SEQ ID NO:11)其中彼此单独地：X1＝A或WX2＝E或RX3＝V或Q，前提条件是当X1是A时，X2＝R，并且当X2＝E时，X1＝W。3.权利要求2的Fc
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结合多肽，其中X3＝V。4.任一项前述权利要求的Fc
‑
结合多肽，进一步包含1
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20个氨基酸的前导序列。5.权利要求4的Fc
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结合多肽，其中所述前导序列由选自以下的氨基酸序列定义，或与选自以下的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如至少90％同一性或至少95％同一性：VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、ADNKFNKE、VDNKFNKE、YEDGVDAKFDKE、AQYEDGKQYTDT和AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE。6.权利要求4的Fc
‑
结合多肽，其中所述前导序列由选自以下的氨基酸序列定义，或与选自以下的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如至少90％同一性或至少95％同一性：VFDKE、AKFDKE、VDA、VDAKFDKE、KFDKE、KVDKE、KADKE、YEDGVDAKFDKE和AQYEDGKQYTDT和AQYEDGKQYTDTVDAKFDKE。7.任一项前述权利要求的Fc
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结合多肽，进一步包含1
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5个氨基酸的尾序列。8.权利要求7的Fc
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结合多肽，其中所述尾序列由选自以下的氨基酸序列定义，或与选自以下的氨基酸序列具有至少60％同一性：AP、APK和APA。9.一种多聚体，其包含多个连接的根据任一项前述权利要求的Fc
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结合多肽。10.权利要求9的多聚体，其是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或七聚体。11.权利要求9或10的多聚体，其中所述多肽通过包含至多25个氨基酸，例如3
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25或3
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20个氨基酸的接头连接。12.权利要求9
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11中任一项的多聚体，其中至少两个多肽通过包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列的接头连接：APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG。13.权利要求9
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11中任一项的多聚体，其中至少两个多肽通过包含与选自以下的氨基酸序列具...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：思拓凡生物工艺研发有限公司，
类型：发明
国别省市：