【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开内容涉及用于从进料中纯化包膜病毒颗粒或外来体的阴离子交换层析介质。提供使用该阴离子交换层析介质从进料中纯化包膜病毒颗粒的方法也是一个目的。
技术介绍
1、慢病毒(lv)被归类为逆转录病毒，并且它有具有逆转录酶的单链rna基因组。慢病毒由具有糖基化蛋白质的病毒包膜组成，所述糖基化蛋白质用作对外细胞膜表面中的宿主细胞受体具有亲和力的配体。病毒在进入细胞后执行病毒遗传物质的转录。病毒基因组由编码特定蛋白质的rna序列组成，所述蛋白质促使病毒序列整合到宿主细胞基因组中。
2、病毒通过对接到宿主细胞表面cd 4糖蛋白上来感染宿主细胞。然后，病毒将其物质注入宿主细胞的细胞质中，其中逆转录酶生成病毒rna的逆转录，从而产生病毒dna基因组，其被送到宿主细胞的核中，在此整合到宿主细胞基因组中。宿主细胞开始转录病毒rna，并表达形成衣壳的病毒蛋白质。然后，lv rna和病毒蛋白质组装，并且当制备了足够的病毒体时，新形成的病毒体离开宿主细胞。
3、在基因疗法中，修饰病毒用作载体以将有益基因插入细胞中。使用lv作为病毒载体的益处是在分裂细胞和非分裂细胞中它可以穿透核膜，不像其它逆转录病毒只在细胞处于有丝分裂时才穿透细胞。
4、在成年人中很多细胞类型不会分裂，并且lv可能是将遗传物质转移到细胞中的唯一选项。用于细胞和基因疗法的基因修饰lv已被证明是用于治愈疾病诸如糖尿病、前列腺癌、慢性肉芽肿病和血管病的有希望的候选项。因此，重要的是修饰病毒基因组，使它不能自我复制，并且永久整合到细胞基因组中。通过基因修饰慢病毒
5、为了产生慢病毒，将几个质粒转染到所谓的包装细胞系中。一种或多种质粒，一般称为包装质粒，编码病毒体蛋白质，例如衣壳和逆转录酶。另一种质粒包含待由载体递送的遗传物质。所述质粒转录以产生单链rna病毒基因组，并通过ψ(psi)序列的存在来标记。用该序列将基因组包装到病毒体中。为了在基因疗法中使用慢病毒，必须从转染后多余的质粒和宿主细胞蛋白质和dna等细胞杂质中纯化病毒体。通常，将收获的产生慢病毒的宿主细胞进行核酸酶处理，并用几种过滤技术纯化慢病毒，例如正向微滤(normal flowmicrofiltration)、超滤和渗滤，以将杂质水平降低到批准的水平。
6、当今慢病毒的下游纯化方法常常与感染性病毒的低回产率同义，因为慢病毒不稳定并且对剪切力、缓冲组分(如盐)敏感，并且在室温快速降解，并且耗时的多步方法也是不利的。lv也只在处理溶液的很窄的ph范围(7.0-7.4)(kinetic analyses of stability ofsimple and complex retroviral vectors,f.higashikawa等,virology 280,124-131(2001))和电导率窗口(<0.2m nacl)(process development of lentiviral vectorexpression,purification and formulation for gene therapy applications,doctoral thesis,sara nilsson,ucl,2016)内稳定，这使得下游纯化方法对在最终制剂中获得高产率的感染性lv具有挑战性。
7、因此，需要的是从进料中纯化慢病毒颗粒以及其它包膜病毒颗粒的改善的方法或至少替代的方法。
技术实现思路
1、本公开内容的一个目的是提供用于纯化包膜病毒颗粒或外来体的阴离子交换层析介质。提供使用这种阴离子交换层析介质从进料中纯化包膜病毒颗粒或外来体的方法也是一个目的。
2、本专利技术由所附的独立专利权利要求限定。非限制性实施方案来自于从属专利权利要求、附图和以下描述。
3、根据第一个方面，提供了一种用于从进料中纯化包膜病毒颗粒或外来体的阴离子交换层析介质，所述阴离子交换层析介质包括用配体官能化到10-500μmol/ml离子容量的载体材料，所述配体包含产生至少一种弱阴离子交换基团的二胺官能团。
4、阴离子交换层析介质可用于纯化包膜病毒颗粒或外来体。包膜病毒从宿主细胞中出芽，并具有源自于含有病毒糖蛋白的细胞膜的外部脂质双层。在包膜颗粒内存在含有病毒遗传物质的蛋白质衣壳。包膜对于宿主细胞的感染是关键的(与宿主细胞膜结合并融合)，但包膜对例如剪切力、盐、ph和洗涤剂非常敏感。生产和纯化期间的条件对于保留病毒感染力和使功能性感染性病毒的回产率最大化是重要的。这样的包膜病毒的实例为dna病毒，例如疱疹病毒、痘病毒、嗜肝dna病毒和非洲猪瘟病毒；rna病毒，例如黄病毒、甲病毒、披膜病毒、冠状病毒、丁型肝炎、正粘病毒、副粘病毒、棒状病毒、布尼亚病毒和线状病毒；以及逆转录病毒，例如慢病毒。
5、载体材料用配体官能化到离子容量(每ml介质的带电荷官能团的数量(μmol/ml))为10-500μmol/ml，或在50-300μmol/ml或100-300μmol/ml范围内。对于这些种类的包膜病毒颗粒或外来体不存在已知的亲和性配体。由于对可能损害病毒的苛刻的洗脱条件的共同要求，针对包膜病毒的亲和性配体的开发具有挑战性。离子交换捕获解决方案将使更温和的洗脱条件成为可能，并且将生成具有更高回产率的改善方法。
6、至少一种弱阴离子交换基团可以包含多模式弱阴离子交换基团，即，阴离子交换基团提供至少两个不同、但协同的位点，其与待结合的化合物(即包膜病毒颗粒或外来体)相互作用。例如，这些位点中的一个可以在配体和感兴趣物质之间给出吸引型电荷-电荷相互作用。另一个位点可以通过引入第二局部电荷或通过增加溶剂化水的局部量来有助于结合，这影响着结合容量。
7、在6-10的ph下，弱阴离子交换基团可以带正电荷或部分带正电荷。
8、这样的带正电荷或部分带正电荷的弱阴离子交换基团可以吸引在中性ph下带负电荷的包膜病毒颗粒或外来体，例如慢病毒颗粒。
9、在6-10或6-9.5、6-9或6-8的ph下，弱阴离子交换基团可以带正电荷或部分带正电荷。
10、弱离子交换基团意味着存在根据ph的梯度从完全带电荷到不带电荷、在pi具有中性电荷(相同量的+和-)。相反地，基于季胺的强阴离子交换基团总是带电荷。不基于季胺的几乎所有其它阴离子交换基团都是弱的，即电荷在所使用ph的合理范围(例如ph 2-11)内变化(并且可以为零)。
11、配体或配体的一部分可以由下式描述：
12、
13、其中x选自h、oh或c1-3基团，并且
14、r1、r2、r3和r4独立选自h和c1-3基团，
15、其中c3基团为直链或支链，
16、其中c1-3基团包含独立选自oh、o-c1-2、s-c1-2、nh、nhr、nr2的基团，
17、其中r选自h和c1-3基团。
18、配体或配体的一部分可以由上式描本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于从进料中纯化包膜病毒颗粒或外来体的阴离子交换层析介质(1)，所述阴离子交换层析介质包括用配体官能化到10-500μmol/mL离子容量的载体材料，所述配体包含产生至少一种弱阴离子交换基团的二胺官能团。
2.根据权利要求1所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述弱阴离子交换基团在6-10的pH下带正电荷或部分带正电荷。
3.根据权利要求1或2所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述配体或配体的部分由下式描述：
4.根据权利要求3所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述配体选自N,N,N'-三乙基乙二胺、二亚乙基三胺、N,N'-二甲基乙二胺、N-甲基乙二胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基-2-羟基丙烷、2-甲基-1,3-丙二胺和N,N-二乙基乙二胺。
5.根据前述权利要求中任一项所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述配体为N,N-二乙基乙二胺。
6.根据前述权利要求中任一项所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述载体材料选自整料、膜、多孔珠、无孔珠、磁珠或膨胀床介质。
7.根据前述权利要求中任一
8.根据前述权利要求中任一项所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述配体通过选自多糖结构和聚合结构的延伸基基团连接到载体材料。
9.一种包含根据权利要求1至8中任一项所述的阴离子交换层析介质(1)的阴离子交换层析法(2)。
10.一种从进料中纯化包膜病毒颗粒或外来体(3)的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法进一步包括在洗脱步骤(202)后，将洗出液加入(203)多模式层析树脂中。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于从进料中纯化包膜病毒颗粒或外来体的阴离子交换层析介质(1)，所述阴离子交换层析介质包括用配体官能化到10-500μmol/ml离子容量的载体材料，所述配体包含产生至少一种弱阴离子交换基团的二胺官能团。
2.根据权利要求1所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述弱阴离子交换基团在6-10的ph下带正电荷或部分带正电荷。
3.根据权利要求1或2所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述配体或配体的部分由下式描述：
4.根据权利要求3所述的阴离子交换层析介质(1)，其中所述配体选自n,n,n'-三乙基乙二胺、二亚乙基三胺、n,n'-二甲基乙二胺、n-甲基乙二胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基-2-羟基丙烷、2-甲基-1,3-丙二胺和n,n-二乙基乙二胺。
5.根据前述权利要求中任一项所述的阴离子交换层析介质(1)，...
【专利技术属性】
技术研发人员：JL·马卢瓦塞尔，A·哈格纳麦克沃特，O·林德，F·勒鲁，
申请(专利权)人：思拓凡生物工艺研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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