分离腺相关病毒衣壳的方法、通过该方法获得的组合物及其用途技术

本公开涉及一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括以下步骤：a)将包含腺相关病毒衣壳的液体样品添加到色谱材料，其中所述液体样品包含纯度为至少90％并且浓度为至少10<supgt;12</supgt;个腺相关病毒衣壳/ml的腺相关病毒衣壳，其中至少10％的腺相关病毒衣壳为完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳，其中所述色谱材料包含强或部分强的阴离子交换色谱材料，所述阴离子交换色谱材料包含载体和用于与腺相关病毒衣壳结合的配体；其中所述色谱材料包含将配体连接至载体的表面延伸剂，其中所述表面延伸剂为聚合物，其中所述聚合物选自：(i)具有天然存在的骨架的聚合物，如多糖，如淀粉、纤维素、葡聚糖或琼脂糖；和(ii)具有合成骨架的聚合物，如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺或聚乙烯基醚；b)从色谱材料洗脱完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳；其中将步骤(b)中洗脱的腺相关病毒衣壳洗脱成洗脱物级分，合并的洗脱物级分包含步骤(a)中添加的液体样品的腺相关病毒衣壳的至少50％，其中至少60％的腺相关病毒衣壳完整包装遗传物质。还公开了通过所述分离方法获得的组合物，包括药物组合物，以及这样的组合物的用途，和阴离子色谱材料用于分离腺相关病毒衣壳的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本公开涉及腺相关衣壳的分离领域并涉及用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，以及阴离子交换色谱材料用于这样的分离的用途。还公开了通过所述方法获得的组合物，包括药物组合物，以及这样的组合物的用途。

技术介绍

1、腺相关病毒(aav)为无包膜病毒，其具有线性单链dna(ssdna)基因组并且可经工程改造以将dna递送至靶细胞。重组腺相关病毒(raav)载体已成为最通用且最成功的基因疗法递送载体之一。使用病毒载体进行基因疗法的需求在不断增加。aav载体是开发针对肌肉疾病以及其他病症的新型基因疗法最有吸引力的基因转移工具之一。大多数早期的aav基因转移研究使用aav血清型2(aav2)。为了进一步改善aav介导的基因转移的效率和特异性，已通过病毒基因组工程改造和/或衣壳修饰开发出许多aav血清型和变体。近年来，血清型如aav8和aav9的使用有所增加。靶器官决定血清型的选择。为了在治疗中使用aav颗粒作为载体，有必要在转染后纯化病毒颗粒以去除dna等细胞杂质。超速离心是高效的但不可扩展。通常，使用若干过滤步骤和若干色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述强阴离子交换色谱材料的所述配体由下式I定义：

3.根据权利要求2所述的方法，其中R1、R2和R3中的每一个为CH3。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述强或部分强的阴离子交换色谱材料的所述配体由下式II定义：

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体由式III定义并包含以下结构(i)-(iv)中的两种或更多种的组合：

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述表面延伸...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.一种用于将完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳与不完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳分离的方法，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述强阴离子交换色谱材料的所述配体由下式i定义：

3.根据权利要求2所述的方法，其中r1、r2和r3中的每一个为ch3。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述强或部分强的阴离子交换色谱材料的所述配体由下式ii定义：

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述配体由式iii定义并包含以下结构(i)-(iv)中的两种或更多种的组合：

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述表面延伸剂为葡聚糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述葡聚糖具有约10至约2000kda、如约40kda的分子量。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述葡聚糖的密度为约5至约30mg葡聚糖/ml所述强或部分强的阴离子交换色谱材料。

9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中步骤(a)和(b)包括施加ph为约6.0至约10.5、如约7,5至约9.5的缓冲液，任选地其中所述缓冲液包含三(羟甲基)氨基-甲烷(即，tris)、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(即，双-tris丙烷)、三乙醇胺、n-甲基二乙醇胺、二乙醇胺、1,3-二氨基丙烷或乙醇胺。

10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括施加包含将改善完整包装遗传物质的衣壳与不完整包装遗传物质的衣壳之间的分离的化合物的缓冲液，任选地其中所述化合物选自碳水化合物、二价金属离子和去污剂；任选地其中所述碳水化合物选自蔗糖、山梨糖醇和多糖；任选地其中所述二价金属离子选自mg2+、fe2+和mn2+，任选地其中所述二价金属离子以盐的形式存在，任选地与氯离子或硫酸根离子组合；任选地其中所述去污剂选自泊洛沙姆和聚山梨醇酯。

11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述色谱材料的所述载体包含颗粒、纳米纤维、整料或膜结构；

12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述色谱材料为精制色谱材料。

13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)中添加的所述液体样品为经预纯化的液体样品。

14.根据任一前述权利要求所述的方法，所述方法还包括(a1)通过从含有腺相关病毒衣壳的细胞培养物收获物分离腺相关病毒衣壳来预纯化腺相关病毒衣壳，从而获得包含腺相关病毒衣壳的经预纯化的液体样品，然后根据权利要求1的步骤(a)将所述包含腺相关病毒衣壳的经预纯化的液体样品添加到所述色谱材料，任选地其中所述预纯化包括使所述含有腺相关病毒衣壳的细胞培养物收获物经受色谱法或经受澄清、然后色谱法。

15.根据任一前述权利要求所述的方法，所述方法还包括使权利要求1的步骤(b)中洗脱的所述包含完整包装遗传物质的腺相关病毒衣壳的洗脱物级分经受以下步骤中的一个或多个：

16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述腺相关病毒衣壳为腺相关病毒血清型8(aav8)、腺相关病毒血清型5(aav5)、腺相关病毒血清型1(aav1)、腺相关病毒血清型2(aav2)、腺相关病毒血清型4(aav4)、腺相关病毒血清型6(aav6)、腺相关病毒血清型7(aav7)、腺相关病毒血清型9(aav9)或腺相关病毒血清型10(...

【专利技术属性】
技术研发人员：JL·马卢瓦塞尔，A·哈格纳麦克沃特，O·林德，H·布罗姆，
申请(专利权)人：思拓凡生物工艺研发有限公司，
类型：发明
国别省市：