本发明专利技术公开了一种黑平菇蛋白ＰｏＡＰ及其制备方法，首先将黑平菇菌丝干粉在磷酸缓冲液中浸提１～３小时，离心，收集上清液；然后分别向所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为４０％和７０％，２～６℃放置６～１２小时，离心，收集沉淀；用磷酸缓冲液溶解沉淀，接着用重蒸馏水进行透析；再经阴离子交换柱分离，用０．５Ｍ ＮａＣｌ洗脱，收集洗脱峰；然后经３０ＫＤ超滤管超滤，５０００ｒｐｍ离心超虑４０ｍｉｎ，所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。本发明专利技术黑平菇蛋白ＰｏＡＰ为单一蛋白，可进行遗传工程应用；其次，对烟草花叶病毒抑制效果好；且为天然提取物，对人类和环境均无害；另外，黑平菇蛋白制备方法简单，原料易得，成本较低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物农药领域，具体涉及一种抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制 备方法和用途。
技术介绍
植物病毒病害种类繁多、分布广泛，且防治困难，每年都给农业生产造成严重损失(杜春梅等，2004)，是仅次于真菌的第二大类植物病害。烟草花叶病 毒(7bZ acco历ossic i^ms1, TMV)为烟草花叶病毒属(7b6柳ow'/7/s1 fr。〃/ ) 的模式种，自苗床至大田皆可发生，田间发病率一般在5 20%，幼苗期或大田 期感染损失可达30 50%，严重者绝收。目前已有多类化学农药在防治植物病毒病害方面应用，但其效果并不理想， 且随着人们对生态环境的重视，化学农药的发展和应用受到了限制。而生物农 药由于其有效成分多为天然物质，施用后在自然界有其顺畅的降解途径，对环 境污染小、对人、畜毒性低等特点日益受到人们的青睐。不同种类的外源抗病毒活性蛋白分别从植物、动物和微生物中得到分离。 1925年Duggar从美洲商陆(州j^c^3ccs J顶erica朋)中发现了具有抗植物病毒 的活性物质(Duggar， 1925)，食用真菌来源的抗植物病毒蛋白的发现要相对晚 一些，迄今从食用菌中分离纯化出抗植物病毒蛋白还很少。1987年，由 Kobayashi等人首次报道了香菇(Ze/7"/ ^ 子实体中植物病毒侵染抑 制剂，即FBP(fruiting body protein, FBP)蛋白。孙慧等(2001年，2003年) 公开了一种抑制TMV侵染的杨树菇(^rocj^es塔erite)蛋白AAVP (^rocWe aegen'ta antiviral protein, AAVP)。付鸣佳等(2003年)公开了一种抗TMV 侵染的金针菇(/^3顺"^'/ a ^^;"/ m)蛋白，命名其为Zb蛋白。黑平菇是平菇(Z^ei/ro"so5^e"ws)的一个菌种，生活力强，进行生料 或熟料栽培，栽培方法简便、管理粗放，生长周期短、产量高。专利申请《一 种黑平菇提取物及其制备方法与应用》(申请号为200810223438.0)公开了一 种具有抗植物病毒作用的黑平菇蛋白提取物，但是没有明确蛋白提取物中哪种活性物质具有抗植物病毒的作用，有待进一步的研究和探索。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种抗植物病毒的黑平菇蛋白。 本专利技术另一目的在于提供上述黑平菇蛋白的制备方法。本专利技术还一 目的是提供上述黑平菇蛋白在抗烟草花叶病毒病上的应用。 实现本专利技术的技术方案如下本专利技术一种抗植物病毒的黑平菇蛋白，所述黑平菇蛋白来自黑平菇(尸2e,o^9oWres^ ),其N端氨基酸序列为DAATGYRSVAYFVNWAIYGR (SEQ ID No:l)。上述抗植物病毒的黑平菇蛋白，按照如下方法制备(1) 将黑平菇菌丝干粉与PH7. 0 9. 0的磷酸缓冲液混合，在2 6。C浸提 1 3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；(2) 向所得黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铰至饱和度为40%,于2 6。C放 置6 12小时，离心，收集上清液；(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于2 6"C放 置6 12小时，离心，收集沉淀，得黑平燕蛋白粗提物；(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 pH6. 0 9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析8 16小时；(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。按照通用的命名方法，将上述所得黑平菇蛋白命名为PoAP (We"r^ZAs ostreattAS Antivirus Protein)。上述黑平菇蛋白步骤(1)中所述的黑平菇菌丝干粉与磷酸缓冲液之间的混 合比例为lg: 10 20ml。上述黑平菇蛋白步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的pH值为8.0。上述黑平菇蛋白步骤(1)、(2)或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。上述黑平菇蛋白步骤(1)、 (2)或步骤(3)中所述的离心的时间为25min。所述的黑平恭菌丝干粉可于市场上购买得到。上述黑平菇蛋白的制备方法，包括如下步骤(1) 将黑平菇菌丝干粉与pH值为7. 0 9. 0的磷酸缓冲液的混合，在2 6。C浸提l 3小时，离心，收集上清液，得黑平菇菌丝粗提液；(2) 向黑平菇菌丝粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，于2 6。C放置6 12小时，离心，收集上清液；(3) 向步骤(2)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为70%，于2 6。C放 置6 12小时，离心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 pH6. 0 9. 0的PBS缓冲液将所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸馏水中透析8 16小时；(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物经阴离子交换柱分离，用0. 5MNaCl洗脱 时收集洗脱峰；(6) 收集的洗脱峰经30KD超滤管超滤，再经5000rpm离心超虑40min， 所得溶液中的物质即为黑平菇蛋白。上述制备方法步骤(1)中所述的黑平菇菌丝干粉的重量与磷酸缓冲液的混 合比例为lg: 10 20ml。上述制备方法步骤(1)中所述的磷酸缓冲液的PH值为8.0。 上述制备方法步骤(1)、 (2)或步骤(3)中所述的离心的速度为10000rpm。 上述制备方法步骤(1)、 (2)或步骤(3)中所述的离心的时间为25min。 上述制备方法中如无特别说明，均为常规方法。本专利技术黑平菇蛋白可用于防治植物病毒，如烟草花叶病毒等。具体方法为 将本专利技术黑平菇蛋白用水稀释至蛋白总浓度为100 200ug/mL，喷施于3 4叶、'本专利技术具有的优点和有益效果(1)本专利技术将抗植物病毒的黑平菇蛋白具 体为一种单一的蛋白，从为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础，进而为遗传工程应用该蛋白提供了可能；(2)本专利技术黑平菇蛋白对植物病毒的 抑制效果好，如在黑平菇蛋白浓度为200ug/mL，喷施烟草72小时后，对烟草 花叶病毒的抑制率达到77. 49%; (3)本专利技术黑平菇蛋白为天然提取物，对人类 和环境均无害，使用安全；(4)本专利技术黑平菇蛋白制备方法简单，原料易得， 成本较低，适于大规模的生产和应用。 附图说明图1本专利技术黑平燕蛋白PoAP电泳鉴定图谱；其中1为标准 子量，2为本 专利技术黑平菇蛋白。图2a为用分子筛(Gel filtration)鉴定蛋白分子量的标准曲线图， 其中A为牛血清白蛋白、B为鸡卵清蛋白、C为胰蛋白酶。图2b为用分子筛(Gel filtration)鉴定黑平菇蛋白分子量的层析图。 具体实施例方式下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中 所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 实施例l本专利技术黑平菇蛋白的制备按照如下方法进行(1) 将黑平菇菌丝干粉(购于宜昌森源食用菌有限责任公司)2g与pH值 为8.0的磷酸缓冲液20mL的混合，在4'C浸提2小时，10000rpm离心25min;弃沉淀，上清即为黑平菇菌丝粗提液。(2) 向所得黑平燕菌丝粗提液中加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗植物病毒的黑平菇蛋白，其特征在于所述的黑平菇蛋白来自黑平菇（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ），其Ｎ端氨基酸序列为：ＤＡＡＴＧＹＲＳＶＡＹＦＶＮＷＡＩＹＧＲ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建华，严红，燕继晔，周莹，李兴红，朱琳，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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