本发明专利技术公开了一种裂褶菌抗病毒蛋白，属于植物病害防治领域。本发明专利技术主要是将裂褶菌菌丝粉在磷酸缓冲液中浸提，离心后获得粗提液；然后加入硫酸铵进行沉淀，再经透析、离子交换层析、超滤浓缩和凝胶层析，获得单一的裂褶菌抗病毒蛋白，其分子量约为28.5kDa。本发明专利技术还公开了裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法，以及在在防治烟草花叶病毒病上的应用。本发明专利技术裂褶菌抗病毒蛋白对烟草花叶病毒的防治效果好，在喷施烟草72小时后，对烟草花叶病毒的抑制率可达到65%以上；其次，本发明专利技术裂褶菌抗病毒蛋白为单一蛋白，为以后的测序和基因工程应用奠定了基础；本发明专利技术裂褶菌抗病毒蛋白为天然提取物，对人类和环境无害，可用于开发生物农药。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病害防治领域，具体地说涉及一种裂褶菌抗病毒蛋白，以及该蛋白的制备方法和和用途。
技术介绍
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，简称为:TMV)能侵染爺科、葫芦科、十字花科等300多种植物,是危害广泛的植物病毒之一。目前，对于植物病毒病尚未有有效的防治方法。食用菌中的活性物质在提高免疫力、抗菌、抗癌方面有一定的作用。目前，对于食用菌中的活性物质的应用多集中在医学领域，而用于植物病毒防治方面则较少。裂裙菌(Schizophyllum commune Fr.)又称白参、树花，属于裂裙菌科(Schizophyllaceae),裂裙菌属(Schizophyllum)。裂裙菌广布于世界各地，我国大部分地区也都有分布。裂褶菌中含有多种抗菌消炎、抗肿瘤，抗辐射等活性物质。目前，对裂褶菌多糖研究较多，如专利申请《具有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法》(公开号:CN101766644A)公开了包括裂褶菌多糖在内的几种蘑菇多糖组合物在提高免疫活性和促进细胞因子方面的作用；《免疫刺激剂》(公开号:CN1798563A)公开了裂褶菌多糖在内的多糖复合体作为免疫刺激剂的用途；《裂褶菌多糖在防治烟草花叶病毒病上的应用》(专利号:ZL2011101609475)公开了裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶病毒病上的用途。有关裂褶菌蛋白方面，专利《裂褶菌蛋白提取物及其制备方法和应用》(专利号:ZL200810247561)公开了裂褶菌蛋白提取物在抗烟草花叶病毒病上的用途。李洋等(李洋等.中国农学通报.2012年第24期250-255页)公开了裂 褶菌蛋白粗提液对烟草花叶病毒的钝化作用，但上述研究并未明确具体是哪种蛋白质在发挥作用。因此，有必要对其进行进一步研究，以便更好地加以应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种裂褶菌抗病毒蛋白。本专利技术另一目的在于提供上述裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法。本专利技术第三目的在于提供上述裂褶菌抗病毒蛋白在防治烟草花叶病毒病上的应用。实现本专利技术的技术方案如下:本专利技术一种裂裙菌抗病毒蛋白(其英文名称为:Schizophyllum communeantiviral protein,简称为:ScAP),其中所述的裂裙菌抗病毒蛋白来自于裂裙菌,其分子量为 28.5kDa。上述裂褶菌抗病毒蛋白中所述的病毒是指烟草花叶病毒等。 上述裂褶菌抗病毒蛋白，按照如下方法制备:(I)、按照裂褶菌菌丝粉与磷酸缓冲液之间重量体积比为Ig:10 20mL的比例，将裂褶菌菌丝粉与25mM、pH8.0的磷酸缓冲液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液；(2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min，收集上清液；(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集沉淀；(4)、将步骤(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸缓冲液溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10-12h，每3小时更换I次超纯水；再将透析袋中的液体在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心30min,收集上清液；(5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，所用层析柱为HiTrap ANX FF(high sub),用洗脱液A进行洗脱,流速为lmL/min,收集280nm下吸收峰溶液；将所得吸收峰溶液进行超滤浓缩，得浓缩溶液；所述的洗脱液A为20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ；(6)、将步骤(5)超滤浓缩后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，用洗脱液B进行洗脱，流速为0.4mL/min，检测280nm下紫外吸收值，收集第3个吸收峰，所得即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脱液B为50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2。上述裂褶菌抗病毒蛋白步骤(I)中所述的裂褶菌菌丝粉的粒径< 60目。上述裂褶菌抗病毒蛋白步骤(5)中所述的离子交换层析在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行。上述裂裙菌抗病毒蛋白步骤(5)中所述的超滤浓缩是用Amicon Ultra_1550KD超滤离心管(Millipore公司生产)在4°C、4000rpm条件下超滤3-4次，15min/次。 上述裂裙菌抗病毒蛋白步骤(6)中所述的凝胶层析在在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用Superdex20010/300GL层析柱。上述裂褶菌抗病毒蛋白的制备方法，包括如下步骤:(I)、按照裂褶菌菌丝粉与磷酸缓冲液之间重量体积比为Ig:10 20mL的比例，将裂褶菌菌丝粉与25mM、pH8.0的磷酸缓冲液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液；(2)、向步骤(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸铵至饱和度为40%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min，收集上清液；(3)、向步骤(2)所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为85%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心20 30min,收集沉淀；(4)、将步骤(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸缓冲液溶解，然后装入截留分子量为7000Da的透析袋，在超纯水中透析10-12h，每3小时更换I次超纯水；再将透析袋中的液体在4°C、8000 IOOOOrpm条件下离心30min,收集上清液；(5)、将步骤(4)所得的上清液进行离子交换层析，所用层析柱为HiTrap ANX FF(high sub),用洗脱液A进行洗脱,流速为lmL/min,收集280nm下吸收峰溶液；将所得吸收峰溶液进行超滤浓缩，得浓缩溶液；所述的洗脱液A为20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ；(6)、将步骤(5)超滤浓缩后所得的浓缩溶液进行凝胶层析，用洗脱液B进行洗脱，流速为0.4mL/min，检测280nm下紫外吸收值，收集第3个吸收峰，所得即为裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脱液B为50mM磷酸盐缓冲液+0.15M NaCL ；pH7.2。上述制备方法步骤(5)中所述的离子交换层析在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行。上述制备方法步骤(5)中所述的超滤浓缩是用Amicon Ultra_1550KD超滤离心管(Millipore公司生产)在4°C、4000rpm条件下超滤3-4次，15min/次。上述制备方法步骤(6)中所述的凝胶层析在在AKTA Explore上于4°C层析柜中进行；使用 Superdex20010/300GL 层析柱。上述裂褶菌抗病毒蛋白(或称ScAP)在防治烟草花叶病毒病上的应用。本专利技术褶菌抗病毒蛋白的使用方法为将上述裂褶菌抗病毒蛋白的溶液稀释成浓度为40ug/ml，喷施于3 5叶期的烟草、辣椒叶片上。本专利技术具有的优点:(1)本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于所述的裂褶菌抗病毒蛋白来自于裂褶菌，其分子量为28.5kDa；其中所述的病毒是指烟草花叶病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周莹，李洋，严红，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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