本发明专利技术公开了磷脂酰胆碱在制备促进猪FAPs细胞分化聚酯制剂中的应用，属于农业与食品科学领域。本发明专利技术通过筛选多种脂质因子、植物活性成分得到可以有效促进猪FAPs细胞分化聚酯的制剂磷脂酰胆碱，并确定磷脂酰胆碱促进猪FAPs细胞分化聚酯的作用浓度；同时进一步在3D培养条件下验证其作用，可为优质细胞培养肉的高效生产、动物肌内脂肪的沉积调控提供新策略。略。略。
【技术实现步骤摘要】
磷脂酰胆碱在制备促进猪FAPs细胞分化聚酯制剂中的应用
[0001]本专利技术属于农业与食品科学领域，尤其涉及磷脂酰胆碱在制备促进猪FAPs细胞分化聚酯制剂中的应用。
技术介绍
[0002]骨骼肌中的脂肪沉积尤其是肌内脂肪(IntramuscularFat,IMF)沉积与畜禽的肉质形成密切相关，其含量与猪肉的感官、食用品质密切相关，直接决定肉的风味、多汁性、嫩度、色泽等多个指标。近年来，国内外关于IMF沉积机制及其调控的相关研究已取得较大进展，但IMF的细胞来源及其靶向调控策略还需进一步研究。研究发现IMF细胞可由多种干细胞和祖细胞分化而来，如包括侧群细胞(Side population cells,SP cells)、周细胞(Pericytes)、多能间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)、肌卫星细胞(Muscle satellite cells muscle,SCs)、纤维脂肪生成祖细胞(Fibro/adipogenic progenitors,FAPs)等，其中FAPs特异性表达PDGFRα和Sca
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1，是人和小鼠肌肉再生过程中主要细胞来源。FAPs能够向成脂和成纤维方向定向分化，进而导致肌肉中脂肪沉积和纤维化。因此，如何调控FAPs的分化潜能对于维持肌肉生长和稳态及调控肌内脂肪沉积具有重大意义。
[0003]目前关于FAPs分化调控的研究主要集中在人和小鼠上，尽管最近有猪肌肉单细胞测序论文注释到猪FAPs细胞，但尚未发现有FAPs体外培养、分化调控等论文报道。
[0004]目前猪FAPs相关研究处于起步阶段，缺少靶向调控其分化聚酯、调控肌内脂肪沉积的方法；目前培养肉生产的种子细胞主要利用肌卫星细胞，而单一细胞来源培养肉产品的营养成分和正常肌肉组织还要很大区别，其主要原因是肌肉组织包含多种细胞。
技术实现思路
[0005]本专利技术利用免疫磁珠分选技术分离得到猪FAPs细胞，初步建立了FAPs细胞体外2D/3D培养体系以及成脂诱导方法，但是仍然缺少通过营养策略靶向调控其成脂分化进而调控肌内脂肪沉积、改善猪肉品质的方法。本专利技术通过筛选多种脂质因子、植物活性成分得到可以有效促进猪FAPs细胞分化聚酯的制剂。
[0006]本专利技术提供了磷脂酰胆碱在制备促进猪FAPs细胞分化聚酯制剂中的应用。
[0007]优选地，所述制剂中磷脂酰胆碱单独作为有效成分。
[0008]更有选地，所述制剂中还包括辅料。
[0009]本专利技术还提供了一种细胞培养肉的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0010](1)制备海藻酸钠/明胶3D凝胶球
[0011]将0.5g海藻酸钠和0.5g明胶溶于50mL蒸馏水中，得到浓度为2％的海藻酸钠
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明胶溶液(海藻酸钠/明胶混合溶胶)。取1g氯化钙溶于50mL蒸馏水中，得到浓度为2％的氯化钙溶液。将海藻酸钠/明胶溶液逐滴加入氯化钙溶液，交联5
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15min可得到海藻酸钠/明胶3D凝胶球；
[0012](2)在海藻酸钠和海藻酸钠/明胶3D支架上接种FAPs细胞
[0013]在细胞培养板中加入氯化钙溶液，将猪FAPs细胞悬液与海藻酸钠/明胶混合溶胶按照体积比1：1～3混合均匀，逐滴滴入氯化钙溶液中，交联5
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15min形成凝胶球；弃去剩余氯化钙溶液，补充生长培养基，在37℃、5％CO2环境中培养，后进行成脂分化培养，成脂分化培养过程中添加1
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100μM PC，最终获得细胞培养肉。
[0014]优选地，所述步骤(1)中还包括将海藻酸钠溶液、明胶溶液和氯化钙溶液分别于98℃下加热3h，紫外照射3h灭菌，氯化钙溶液经0.22μm滤膜过滤。
[0015]更优选地，所述步骤(2)中猪FAPs细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞汇合率达到75
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85％时，通过胰蛋白酶消化和离心获得猪FAPs细胞悬液。
[0016]更优选地，所述步骤(2)中猪FAPs细胞悬液的浓度为1.5
×
105cell/ml。
[0017]更优选地，所述步骤(2)中交联时间为10min。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]磷脂酰胆碱可明显促进猪FAPs细胞分化聚酯，进而提高肌内脂肪含量。
附图说明
[0020]图1为实施例1中不同营养因子对猪FAPs分化聚酯的影响结果图。
[0021]图2为实施例2中PC对猪FAPs分化聚酯的影响(尼罗红染色)结果图。
[0022]图3为实施例2中PC对猪FAPs脂肪/脂肪酸合成相关基因表达的影响结果图。
[0023]图4为实施例2中PC对猪FAPs脂肪/脂肪酸合成相关蛋白表达的影响结果图。
[0024]图5为实施例3中PC对猪FAPs在3D培养条件下分化聚酯的影响(尼罗红染色)结果图。
具体实施方式
[0025]实施例1促进猪FAPs细胞分化聚酯的营养因子筛选
[0026]1、猪FAPs细胞培养
[0027]传代培养使用的培养基：DMEM+15％FBS+1％双抗；两天换一次液，换液之前用FBS洗两遍；待细胞融合率达到85％时传代。
[0028]传代：弃掉培养基，加2mLPBS清洗细胞，弃掉PBS，加入1.5mL胰酶，在37℃消化3min，加1mL完全培养基，混匀后转移到5mL的离心管，以1000rpm转速离心4min，离心后弃掉上清，用完全培养基重悬后接种到培养板继续培养。
[0029]2、设定营养因子的浓度梯度
[0030]将每个营养因子设置4个浓度梯度：磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)分为0、1μM、10μM、100μM；甜菜碱(betaine，Bet)分为0、0.1mM、0.2mM、0.4mM；表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)分为0、0.2μM、2μM、20μM；磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)分为0、1μM、10μM、100μM；鸟氨酸(Orithine)分为0、0.1mM、0.2mM、0.4mM。
[0031]3、猪FAPs细胞成脂诱导
[0032]上述5种营养因子在成脂分化(包括MDI medium和INS medium)全过程添加，每个处理设置3个重复。
[0033]待猪FAPs细胞生长至融合率为85％时，接种至12孔板培养，待细胞生长至融合率为85％
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90％换用成脂诱导培养基MDI medium诱导FAPs成脂分化4天，然后更换分化培养基
INS medium，继续培养2天。
[0034]MDI medium包含IBMX 500μM、胰岛素10μg/mL、罗格列酮2μg/mL和地塞米松1μM；
[0035]INS medium包含胰岛素10μg/mL。
[0036]4、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.磷脂酰胆碱在制备促进猪FAPs细胞分化聚酯制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂中磷脂酰胆碱单独作为有效成分。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂中还包括辅料。4.一种细胞培养肉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)制备海藻酸钠/明胶3D凝胶球将0.5g海藻酸钠和0.5g明胶溶于50mL蒸馏水中，得到浓度为2％的海藻酸钠/明胶混合溶胶，取1g氯化钙溶于50mL蒸馏水中，得到浓度为2％的氯化钙溶液，将海藻酸钠/明胶混合溶胶逐滴加入氯化钙溶液，交联5
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15min可得到海藻酸钠/明胶3D凝胶球；(2)在海藻酸钠和海藻酸钠/明胶3D支架上接种FAPs细胞在细胞培养板中加入氯化钙溶液，将猪FAPs细胞悬液与海藻酸钠/明胶混合溶胶按照体积比1：1～3混合均匀，逐滴滴入氯化钙溶液中，交联5
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15min形成凝胶...
【专利技术属性】
技术研发人员：单体中，刘事奇，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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