一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备和用途制造技术

本申请的实施例公开了一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途。所述融合蛋白包括包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；其中，所述第一结构单元包含下列的至少之一：Fc片段、抗体或抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的N端或C端连接。本申请的融合蛋白能够提高细胞因子的治疗安全性、靶向性及疗效，并能够与抗体Fab、scFv、VHH或抗原结合肽进一步融合，获得可条件性释放并激活的免疫细胞因子。性释放并激活的免疫细胞因子。性释放并激活的免疫细胞因子。

【技术实现步骤摘要】
一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备和用途


[0001]本申请属于医药
，具体涉及一种可条件性释放并激活的细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途，更具体的，本申请涉及一种融合蛋白，一种核酸，一种表达载体，一种宿主细胞，一种制备融合蛋白的方法，一种融合蛋白复合体，一种免疫治疗细胞，一种药物组合物，以及融合蛋白或融合蛋白复合体在制备用于治疗或者预防癌症、传染病或自身免疫疾病的药物中的用途。

技术介绍

[0002]细胞因子在调节免疫应答方面扮演着重要作用，是肿瘤免疫治疗的基石。多种细胞因子(例如IL
‑
2，IL
‑
7，IL
‑
15等)具有显著的抗肿瘤作用，但半衰期短、靶向性差、全身给药易产生毒副作用等缺陷严重限制了其临床研发进展。目前已开发多种技术，包括Fc融合、PEG修饰、免疫细胞因子、细胞因子前药等，进行下一代细胞因子药物的研究，旨在提高细胞因子的成药性。其中，前体药物能够在正常组织对细胞因子的活性进行掩蔽，在到达肿瘤组织后，通过特异性蛋白酶酶解等方式恢复细胞因子的活性，从而达到靶向抗肿瘤的目标。前体药物在抗体药物领域已有大量研究，且有产品进入临床试验阶段，但在细胞因子领域的应用刚刚开始，是国内外研究的前沿。
[0003]已有报道的细胞因子前药，包括IL
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2、IL
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15、IFN
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γ等，均采用具有亲和力的多肽或受体与细胞因子结合，如IL
‑
15采用IL
‑/>15Rβ/γ亚基结合，屏蔽其结合靶细胞上的IL
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15Rβ/γ，从而掩蔽其功能。但这种亲和掩蔽的的方式存在潜在的药物开发障碍，例如具有亲和力的多肽或受体在肿瘤微环境被剪切后，游离状态下可能仍对细胞因子具有结合作用，影响细胞因子对靶细胞的识别及活性，进而影响抗肿瘤效果；此外，在前药分子中额外的亲和掩蔽多肽或受体会增加分子量、免疫原性及结构复杂性等，因此，目前的细胞因子前药亟需开发新的掩蔽技术。
[0004]免疫细胞因子是将单克隆抗体与细胞因子构建双功能融合蛋白，能够利用抗体的靶向性将细胞因子富集到肿瘤部位，提高细胞因子靶向性，并能够发挥抗体和细胞因子的协同抗肿瘤作用。基于临床前研究所表现出的显著的药效及良好的安全性，国内外制药公司均有在研产品进入临床研究。进展最快的分子为瑞士苏黎世大学和Philogen公司联合研发的L19
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TNF，与阿霉素联合用于治疗转移性软组织肉瘤已进入III期临床研究。然而，研究发现，免疫细胞因子靶向到肿瘤的比例普遍低于0.1％，其副作用水平与所融合的细胞因子单药类似，导致目前临床试验阶段的免疫细胞因子药物的剂量局限于较低的水平，例如L19
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TNF的III期临床剂量仅有13ug/kg，远远低于一般单克隆抗体10
‑
20mg/kg的剂量水平。因此，安全性依然是限制免疫细胞因子临床应用的主要瓶颈之一，对免疫细胞因子进行结构优化，进一步提高靶向性和安全性，是推动此类分子走向临床的关键。

技术实现思路

[0005]鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本申请期望提供一种细胞因子融合蛋白，能够以空间位阻的方式对细胞因子活性进行掩蔽和调节，并能够与抗体类分子进一步融合，获得免疫细胞因子前药，以提高此类药物的治疗靶向性和治疗效果。
[0006]在本申请的一个方面，本申请提供了一种融合蛋白，包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元：所述第一结构单元包含下列的至少之一；其中，Fc片段、抗体或其抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能够被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的N端或C端连接。第一结构单元的空间位阻能够对第三结构单元的结构进行掩蔽，从而调节第三结构单元与其靶细胞的结合，改变其活性。第二结构单元包含可裂解肽接头(在本文中又称可裂解连接子、可裂解的连接子)，可被目的组织(如肿瘤部位过表达的蛋白酶，可选为基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或天冬酰胺内肽酶)裂解。本文中公开的实验显示，本申请的融合蛋白在裂解前后第三结构单元显示出不同的活性，具有更好的靶向性和安全性。
[0007]在本申请的一些实施方式中，本申请的融合蛋白的第一结构单元通过第二结构单元连接于第三结构单元的N端。以第一结构单元包含Fc片段、第三结构单元为细胞因子IL
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15与受体的活性复合物为例，融合蛋白的结构如图1a所示，从N端到C端依次包含抗体Fc片段、可裂解的连接子、IL
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15和IL
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15Rα的sushi结构域。本申请发现，与具有完全活性的Fc
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sushi
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IL
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15超级激动剂蛋白相比(实施例中的LH02融合蛋白)，融合蛋白中IL
‑
15的促细胞增殖活性在第二结构单元裂解前明显更低，在裂解后活性大幅增强，在小鼠体内的安全性得到显著改善。
[0008]在本申请的一些实施方式中，本申请的融合蛋白的第一结构单元通过所述第二结构单元与第三结构单元的C端连接。以第一结构单元包含抗体Fc片段第三结构单元为IL
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15与IL
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15Rαsushi结构域的复合物为例，融合蛋白(命名为LIC18)的结构如图1f所示，从N端到C端依次包含IL
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15Rα的sushi结构域、IL
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15、含有可裂解连接子的第二结构单元和抗体Fc片段。其中sushi结构域与IL
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15之间用柔性连接子连接。本申请发现，相比于sushi
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IL
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15复合物位于Fc的C端的融合蛋白，其位于Fc的N端的融合蛋白在第二结构单元裂解前的活性明显更低，且在第二结构单元被酶切裂解后，活性大幅增强，靶向性和安全性得到显著改善。
[0009]在本申请的一些实施方式中，所述第一结构单元为抗体Fab，其重链和轻链分别通过所述第二结构单元与第三结构单元的N端或C端连接。
[0010]在本申请的一些实施方式中，所述第一结构单元为抗体Fab，其重链和轻链中的一条通过所述第二结构单元与第三结构单元的N端或C端连接。以第一结构单元为靶向PD
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L1的单克隆抗体Fab片段、第二结构单元为包含尿激酶底物的可裂解连接子、第三结构单元为细胞因子IL
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15与含有sushi结构域的IL
‑
15Rα片段复合物为例，将第三结构单元通过第二结构单元融合于第一结构单元重链的C端，所获得的免疫细胞因子(命名为LIC110)结构如图1c所示，其轻链为抗PD
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L1单克隆抗体的轻链，其重链从N端到C端依次包含抗PD
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L1抗体的重链可变区和CH1区、可裂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子融合蛋白，其特征在于，包括第一结构单元、第二结构单元和第三结构单元；其中，所述第一结构单元包含下列的至少之一：Fc片段、抗体或抗原结合片段；所述第二结构单元包含可裂解肽接头，所述可裂解肽接头能被目的组织特异性酶切断裂；所述第三结构单元包含细胞因子或细胞因子与其受体的复合物；所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的N端或C端连接。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的组织包括蛋白酶；任选地，所述蛋白酶选自在肿瘤组织中过表达的蛋白酶；优选地，所述蛋白酶为基质金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或天冬酰胺内肽酶。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述可裂解肽接头包括柔性肽段和/或蛋白酶底物序列；任选地，所述柔性肽段的氨基酸序列包括选自(GS)n、(GGS)n、(GGSG)n、(GSSG)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和(GSGGS)n中的至少之一，n为1～20之间的任意整数；任选地，所述柔性肽段的氨基酸序列长度为1～30个；任选地，所述可裂解肽接头包括柔性肽段和蛋白酶底物序列；任选地，所述可裂解肽接头具有如SEQ ID No:29～SEQ ID No:32任一项所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞因子与其受体的复合物为IL
‑
15与其受体sushi结构域的复合物；任选地，所述IL
‑
15与其受体sushi结构域的复合物包括IL
‑
15
‑
柔性连接子
‑
sushi结构域的融合蛋白。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述柔性连接子包含选自(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和/或(GGGS)n中的至少之一，n为1～20之间的任意整数；优选的，所述柔性连接子的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示。6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
‑
15与其受体sushi结构域的复合物中sushi结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述IL
‑
15为人IL
‑
15分子或人IL
‑
15分子的突变体；任选地，所述人IL
‑
15分子的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；优选的，与所述人IL
‑
15分子的氨基酸序列相比，所述人IL
‑
15分子的突变体包含N72D突变；优选的，所述人IL
‑
15分子的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗体包括选自多抗、全长单抗、Fab抗体、Fab
’
抗体、F(ab
’
)2抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；或者所述抗原结合片段包括选自F(ab
’
)2片段、Fab
’
片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv
‑
Fc融合蛋白、scFv
‑
Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一；任选地，所述第一结构单元通过所述第二结构单元与所述第三结构单元的N端连接；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：路慧丽，史文强，汪阳，宋露瑶，刘泽馨，曾琼雅，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：