本发明专利技术公开了一种检测试纸，该试纸包含：（１）反应支持物；（２）吸水垫；（３）硝酸纤维膜，该膜包被有单增李斯特菌Ｐ６０抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；（４）金标抗体吸附膜，其中含有胶体金标记的单增李斯特菌Ｐ６０抗体；（５）样品垫。本发明专利技术试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对单增李斯特菌的感染诊断起到辅助作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种单增李斯特菌的检测试纸 及其制备方法和在单增李斯特菌中的应用。
技术介绍
单核纟田胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，单增李斯特菌)， 是李斯特菌属(Listeria)中最重要的人类食源性病原菌，也是一种人畜 共患的致病菌，属李斯特菌属，它可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败 血症、心内膜炎、流产、死胎及脓肿等，发病者死亡率可达30%—40%。近 年来已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件。 因此，世界各国政府部门对单增李斯特菌引起的食物中毒越来越重视， 纷纷制定了一些新的食品安全法规，并把单增李斯特菌纳入法定强检项 目。目前单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离养和生化鉴定， 该方法费时费力。胶体金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来 发展起来的一项新型体外诊断技术。近年来该方法发展迅速，在生物医 学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但用于食品卫生领域检测的 产品较少。本研究针对单增李斯特菌研制出了食品污染单增李斯特菌的 免疫胶体金检测试纸条。本研究建立的胶体金检测方法灵敏、准确、特 异性强，可进一步应用到检验检疫部门对进出口食品中单增李斯特菌的 检测实际工作中。此方法建立后，可与经典常规方法互补，预计将在检 验检疫、食品工业部门及卫生监控部门具有较广的应用前景，有一定的 经济和社会效益。同时，可为食品微生物检验国际方法的修订或增补提 供科学依据。荧光定量PCR和传统细菌培养，此两种方法检测时间均较长，最快仍 需8小时，并且需要指定的实验环境和昂贵的仪器，PCR还易出现假阳性， 不适合现场快速检测，并且不能进行定量^r测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种方便、快捷地检测单增李斯特菌的试纸， 同时可利用金标免疫分析仪进行的半定量检测方法。该试纸的工作原理 是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合 后，使与试纸上结合的捕获抗体显色。本专利技术还涉及制备上述检测试纸 的制备方法。本专利技术能够基于一份标本和一个试纸，快速方^f更地;险测出标本中的 单增李斯特菌，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。本专利技术涉及一种方便、快捷地检测单增李斯特菌的检测试纸，它包含(l)反应支持物； (2 )吸水垫；(3 )硝酸纤维膜，该膜包被有单增李斯特菌P60多克隆抗体(例如 可来自吉林省出入境检验检疫局)检测条带和质控羊抗兔IgG (例如购自 鼎国生物技术有限公司)的质控条带。(熊国华，于莉，曹际娟等，单增 李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测J中国公共卫生杂志2008年2 月第24巻第2期)(4 )金标抗体吸附膜，其中含有胶体金标记的单增李斯特菌P60多抗。本专利技术涉及的上述单增李斯特菌的检测试纸，它还包含样品垫。本专利技术涉及的上述单增李斯特菌的检测试纸，其中反应支持物选用 PVC板。本专利技术涉及的上述单增李斯特菌型的^r测试纸，其中吸水垫选用滤纸。本专利技术涉及的上述单增李斯特菌的检测试纸，其中金标抗体吸附膜 选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。另一方面，本专利技术涉及的上述单增李斯特菌的检测试纸，其中吸水 垫、硝酸纤维膜、金标抗体吸附膜、样品垫和反应支持物按照附图1所 示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5 上的中部，该膜的T处是单增李斯特菌P60多克隆抗体包被的检测条带，5并且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体吸附膜3位于硝酸纤 维膜上部的一側并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的单增李斯特菌 P60多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体吸附 3而言的另一侧并与2部分重叠；样品垫4位于2上与1相反的一侧并与 3部分重叠。又一方面，本专利技术涉及的上述单增李斯特菌的检测试纸，以吸水垫 一側为起始端，样品垫一侧为末端，单增李斯特菌P60多克隆抗体的检 测条带位于接近末端，羊抗兔IgG包被的质控条带接近于起始端。本专利技术再 一 个目的是提供制备所述检测单增李斯特菌的试纸的方 法，该方法包括以下步骤胶体金探针的制备，金标抗体吸附膜的制备， 硝酸纤维膜的喷涂包被。 1、胶体金探针的制备(1)将HAuC14先配制为0. 01°/。水溶液。》兹力搅拌下准确加入1 ml 1% 的HAuC14，同时加入1.5-3ml 1%的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续 加热，冷却至室温后加纯水补足至IOO ml， 4 。C避光保存。(2 )用K2C03调PH值为约7-9，优选为约7. 8 - 8. 9,更优选约8. 2-8. 5。(3) 将胶体金调至pH 8.2-8.5，，用5 mM PB (pH 7.2)稀释抗体 至O. 2 mg/ml。(4) 保持胶体金稳定。本专利技术还在于提供一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的 方法，该方法包4舌a. 取10支洁净的l. 5 ml离心管，分别加入胶体金溶液lml。b. 在l-10号管内分别加入IO ml、 20 ml、 30 ml、 40 ml、 50ml、 60 mi、 70 ml、 80 ml、 90 ml、 100ml的PBS，再依次加入稀释好的O. 2 mg/ml 的待标记抗体90 ml、 80 ml、 70 ml、 60 ml、 50 ml、 40 ml、 30 ml、 20 ml、 10 ml、 0 ml,混勻，静置2分钟。c. 在10个管内分别加入10。/。 NaCl溶液IOO ml，混匀后室温静置2小 时，观察颜色变化。未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红 变蓝的变化，而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色不变。与对照管(1号管)相比，颜色最接近、含抗体剂量最低的试管所含的抗体剂量，即为l ml胶体金所必须的抗体稳定剂量，在此基础上 再加20%抗体，即为抗体最佳标记剂量。本专利技术经过反复试验和分析，得 出的结果表明维持胶体金溶液适宜抗体量为2-10ug，优选抗体量5-9ug，更优选6. 2-8. 2ug,最优选为7. 2ug。2、 金标抗体吸附膜的制备取上述pH的胶体金以lml/管分装于1. 5 ml的离心管中。每支管中 力口入3-8 ug标记剂量，优选抗体量4-6 ug，更优选4. 5-5. 5 ug,最优 选为5ug的抗体，轻摇混匀后放置。每管中加入10%的BSA100 1，混 匀放置。将上面初步制得的胶体金探针在12000 rpm、 4。C下离心30分钟， 弃上清液。每支离心管中加入l ml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清 液，管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500 1重悬液重悬后于4 。C, 1000 rpm,离心10分钟；取上清液，均匀滴加在lcm宽的^C璃纤维上， 37'C干燥。3、 硝酸纤维膜的喷涂包被(1 )利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被单增李斯特菌P60 多克隆抗体和质控羊抗兔IgG两个条带的硝酸纤维膜；在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s,更优选是 45 - 55mm/s,最优选是50mm/s;所述单增李斯特菌P60多克隆抗体，其加 入量为l-5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液可以为PBS;质控羊抗兔IgG可 以购自鼎国生物技术公司，其浓度为O. 1-5 mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测试纸，其特征在于，它包含： （１）反应支持物； （２）吸水垫； （３）硝酸纤维膜，该膜包被有单增李斯特菌抗体和质控抗体的检测条带和质控条带； （４）金标抗体吸附膜，其中含有胶体金标记的单增李斯特菌Ｐ６０抗体； （５）样品垫。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王静，王振国，谢士嘉，杨宇，孙肖红，胡孔新，张晓龙，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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