一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物、探针及其检测方法技术

本发明专利技术属于沙门氏菌检测技术领域，具体涉及一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物、探针及其检测方法；本申请公开了一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物和探针，用于检测沙门氏菌的RPA引物和探针如下：正引物序列，RPA

【技术实现步骤摘要】
一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物、探针及其检测方法


[0001]本专利技术属于沙门氏菌检测
，具体涉及一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物、探针及其检测方法。

技术介绍

[0002]沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌。沙门氏菌鉴定的传统方法主要是根据形态学特征、培养特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌体特征等。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。
[0003]自1983年引入经典的聚合酶链式反应(PCR)方法以来，核酸扩增已渗透到生命科学的各个领域。然而，尽管PCR具有重要意义，但由于其需要一种复杂的热循环设备，限制了在资源匮乏的环境中的外部应用。新的等温扩增方法为人工核酸复制提供了简化的孵育条件，单一的恒定温度为RPA摆脱实验室空间限制并在野外、现场等资源匮乏环境中进行扩增提供新途径。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中PCR检测存在的其需要一种复杂的热循环设备，限制了在资源匮乏的环境中的外部应用的缺点，提供一种只需在35
‑
37℃下且10
‑
15min之内就能得到检测结果，检测设备小巧易于携带，为现场以及资源匮乏的地方提供更加方便的恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物、探针及其检测方法。本专利技术所述的RPA引物以及探针，应用到检测沙门氏菌时，检测灵敏度与qPCR方法相当，但是却能大大缩短了反应时间提高了，进而提高了检测效率。
[0005]为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用以下技术方案，
[0006]一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物和探针，用于检测沙门氏菌的RPA引物和探针如下：
[0007]正引物序列，RPA
‑
F：TTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC；
[0008]反引物序列，RPA
‑
R：ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA；
[0009]探针序列：
[0010]CGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGG(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
dT)GCCCGGTAAACAGATGA
‑
SpacerC3。
[0011]进一步的，所述RPA引物和探针根据沙门氏菌的invA基因进行设计。
[0012]本专利技术也提供了一种恒温快速检测沙门氏菌的检测方法，包括以下步骤：
[0013]步骤1、RPA引物和探针的设计
[0014]根据沙门氏菌的invA基因进行设计RPA引物和探针，其中RPA的引物组，目的片段大小为233bp
[0015]正引物序列，RPA
‑
F：TTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC；
[0016]反引物序列，RPA
‑
R：ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA；
[0017]探针序列：
[0018]CGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGG(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
dT)GCCCGGTAAACAGATGA
‑
SpacerC3。
[0019]步骤2、设计PCR的引物组
[0020]PCR的引物组，目的片段大小为128bp；
[0021]PCR
‑
F:TGACGGTGCGATGAAGTT；
[0022]PCR
‑
R:TAGACAGAGCGGAGGATA；
[0023]步骤3、建立实时荧光RPA反应体系
[0024]使用TwistAmp exo试剂盒以50μL的体积进行实时RPA反应；将2μL模板DNA和醋酸镁添加到每个反应管中；然后将反应管的荧光分析仪中，在35
‑
37℃下反应10
‑
15min；
[0025]步骤4、按照奶粉检测标准，对婴幼儿奶粉进行检测。
[0026]进一步的，所述步骤3中，每个所述反应管包括：
[0027][0028]进一步的，所述步骤3中的试剂盒还配合其它成分进行使用。
[0029]更进一步的，所述其它成分包括每个420nM引物、120nM探针、14mM乙酸镁、2μLDNA模板、无核酸酶水以及荧光基础缓冲液。
[0030]本技术方案与
技术介绍
相比，至少具有以下优点：
[0031]1.本专利技术所述的恒温快速检测沙门氏菌的检测方法，只需在35
‑
37℃下10
‑
15min之内就能得到检测结果，检测设备小巧易于携带，为现场以及资源匮乏的地方提供更加方便的检测手段；
[0032]2.本专利技术所述的检测方法，检测灵敏度与qPCR方法相当，检测限可达到103cfu/mL，但大大缩短了反应时间提高了检测效率。
具体实施方式
[0033]现有技术中现有PCR方法检测方法耗时长，且其需要一种复杂的热循环设备，限制了在资源匮乏的环境中的外部应用。
[0034]为此，本专利技术提供提供一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物和探针，用于检测沙门氏菌的RPA引物和探针如下：
[0035]正引物序列，RPA
‑
F：TTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC；
[0036]反引物序列，RPA
‑
R：ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA；
[0037]探针序列：
[0038]CGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGG(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
dT)GCCCGGTAAACAGATGA
‑
SpacerC3。
[0039]通过使用上述的RPA引物和探针对沙门氏菌进行检测，只需在35
‑
37℃下10
‑
15min之内就能得到检测结果，以解决上述技术问题。
[0040]为了使本专利技术的目的、特征和优点更加的清晰，以下结合更具体的实施例，对本专利技术的具体实施方式做出更为详细的说明，在下面的描述中，阐述了很多具体的细节以便于充分的理解本专利技术，但是本专利技术能够以很多不同于描述的其他方式来实施。因此，本专利技术不受以下公开的具体实施的限制。
[0041]实施例1
[0042]一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物和探针，所述RPA引物和探针根据沙门氏菌的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物和探针，其特征在于，用于检测沙门氏菌的RPA引物和探针如下：正引物序列，RPA
‑
F：TTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC；反引物序列，RPA
‑
R：ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA；探针序列：CGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGG(FAM
‑
dT)(THF)(BHQ1
‑
dT)GCCCGGTAAACAGATGA
‑
SpacerC3。2.根据权利要求1所述的一种恒温快速检测沙门氏菌的RPA引物和探针，其特征在于，所述RPA引物和探针根据沙门氏菌的invA基因进行设计。3.一种恒温快速检测沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、RPA引物和探针的设计根据沙门氏菌的invA基因进行设计RPA引物和探针，其中RPA的引物组，目的片段大小为233bp正引物序列，RPA
‑
F：TTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCC；反引物序列，RPA
‑
R：ACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAA；探针序列：CGGAAGTCGCGGCCCGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪晗露，雷洋，白佳委，汪大明，
申请(专利权)人：厦门健康工程与创新研究院，
类型：发明
国别省市：