一种用于现场检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于现场检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试剂盒，其采用用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试纸，CRISPR核酸检测试纸是基于消线法的侧向流试纸，利用CRIPSR

【技术实现步骤摘要】
一种用于现场检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试剂盒


[0001]本专利技术属于分子诊断
，具体涉及一种用于现场检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试剂盒。

技术介绍

[0002]自1961年人类首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin
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resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的60年以来，MRSA感染的患者在临床上已经十分常见。MRSA耐药性来自位于葡萄球菌mec(Staphylococcal Cassette Chromosome,mec)盒式染色体中的mecA基因，该基因编码的青霉素结合蛋白(penicillin
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binding protein,PBP2a)可水解破坏β
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内酰胺抗生素，进而产生对β
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内酰胺类抗生素(青霉素、甲氧西林和苯唑西林等)耐药。目前，药敏试验(Antimicrobial susceptibility test,AST)作为检测微生物耐药性(Anti
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microbial Resistance,AMR)的经典方法，能够准确判断病原菌的耐药表型，但是这种基于细菌培养的方法需要几天甚至几周的时间，一定程度上延误了患者的治疗。随着核酸检测技术的发展，研究人员已建立了基于荧光定量PCR(Quantitative Real
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time PCR,qPCR)的MRSA核酸检测方法。荧光定量PCR检测技术虽能实现对耐药基因的快速检测，但仍需依靠专业的实验室和精密的检测设备，不利于基层及偏远地区的医疗卫生机构开展耐药检测。因此，为了进一步推动耐药检测技术的前移下移，便于早期及时发现细菌耐药性的产生，亟需一种更加灵敏、简单且适用于现场的检测方法。

技术实现思路

[0003]基于现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于现场检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试剂盒。
[0004]依据本专利技术技术方案的第一方面，提供一种用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒，其包括用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR
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Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；
[0005]所述用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR
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Cas13a系统包括如下a1)
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a3)；
[0006]a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；
[0007]所述crRNA的靶点序列为序列1；
[0008]a2)报告RNA，其由20个U组成，且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素；
[0009]a3)用于扩增待测样本靶点序列的RAA扩增引物，且所述RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；
[0010]所述侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；
[0011]所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。
[0012]进一步地，所述crRNA的核苷酸序列为序列2。
[0013]更进一步地，所述RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。
[0014]更进一步地，所述CRISPR
‑
Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。
[0015]进一步地，所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：所述检测方法包括如下步骤:
[0016]b1、提取待测样本的核酸，所述RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RAA扩增，得到RAA扩增产物；
[0017]b2、将所述RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；
[0018]b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；
[0019]若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因。
[0020]依据本专利技术技术方案的第二方面，提供用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒中的用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR
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Cas13a系统。
[0021]依据本专利技术技术方案的第三方面，提供用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒或上面CRISPR
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Cas13a系统或所述系统中的单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1
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c10任一中的应用：
[0022]c1)检测或辅助检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因；
[0023]c2)制备检测或辅助检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因产品；
[0024]c3)检测或辅助检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因核酸；
[0025]c4)制备检测或辅助检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因核酸产品；
[0026]c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因；
[0027]c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因产品；
[0028]c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因核酸；
[0029]c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因核酸产品；
[0030]c9)筛选或辅助筛选金黄色葡萄球菌mecA耐药基因防治药物；
[0031]c10)制备筛选或辅助筛选金黄色葡萄球菌mecA耐药基因防治药物产品。
[0032]依据本专利技术技术方案的第四方面，提供一种检测或辅助检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因核酸的方法，包括如下步骤：
[0033]b1、提取待测样本的核酸，所述RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RAA扩增，得到RAA扩增产物；
[0034]b2、将所述RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；
[0035]b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；
[0036]若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有金黄色葡萄球菌
mecA耐药基因；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因。
[0037]与现有技术相比较，本专利技术用于现场检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR核酸检测试剂盒及其所采用的技术基于CRISPR
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Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒，包括用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR
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Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；所述用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的CRISPR
‑
Cas13a系统包括如下a1)
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a3)；a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；所述crRNA的靶点序列为序列1；a2)报告RNA，其由20个U组成，且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素；a3)用于扩增待测样本靶点序列的RAA扩增引物，且所述RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；所述侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。2.根据权利要求1所述的用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列为序列2。3.根据权利要求1或2所述的用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。4.根据权利要求1
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3中任一所述的用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述CRISPR
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Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。5.根据权利要求1
‑
4中任一所述的用于检测金黄色葡萄球菌mecA耐药基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：所述检测方法包括如下步骤:b1、提取待测样本的核酸，所述RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RAA扩增，得到RAA扩增产物；b2、将所述RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有金黄色葡萄球菌mecA耐药基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙岩松，李浩，韩尧，胡强，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：