检测新型冠状病毒N基因的引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供检测新型冠状病毒N基因的引物、探针、试剂盒及方法，目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增技术的引物组、探针组，目的之二在于提供一种用于检测新型冠状病毒的侧向层析试纸条检测试剂盒及方法。本发明专利技术提供的引物探针能够实现口咽拭子中新型冠状病毒的快速准确鉴定，具有操作简单，检测时间短，灵敏度高，特异性强等优势，特别适合于基层和现场检测，具有很广阔的应用前景。本发明专利技术所需的检测时间短，特异性强，重复性好，能通过对人内参基因的检测结果对样本提取和扩增过程进行质量监控，具有较好的实用价值。用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
检测新型冠状病毒N基因的引物、探针、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测领域，具体为一种检测新型冠状病毒N基因的引物、探针、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]近年来发现的一种新型冠状病毒
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
‑
CoV
‑
2，又称新型冠状病毒)，目前主要采用反转录实时荧光定量PCR技术进行检测，其主要针对新型冠状病毒基因组开放阅读框(ORF1ab)和核壳蛋白(N)进行检测。但是RT
‑
PCR方法由于需要昂贵的仪器设备且需要有专业技术人员操作，且现有的RT
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PCR方法检测新型冠状病毒SARS
‑
CoV
‑
2时间长，操作复杂，因此，在基层和现场快速检测应用收到很大的限制，受检测速度及检测人员的限制，会导致大量疑似病例的样本积压，不能快速得到结果。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术一种检测新型冠状病毒N基因的引物、探针、试剂盒及方法，目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的重组酶聚合酶扩增技术(LF
‑
RPA)的引物、探针，目的之二在于提供一种用于检测新型冠状病毒的侧向层析试纸条检测试剂盒，以实现新型冠状病毒的快速准确检测。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术一方面提供一种检测新型冠状病毒N基因的引物、探针，所述引物用于扩增新型冠状病毒N基因；所述探针用于检测新型冠状病毒N基因；
[0005]所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物为N
‑
F1、N
‑
F2、N
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F3、N
‑
F4中的一种；所述反向引物N
‑
R1、N
‑
R2、N
‑
R3、N
‑
R4中的一种；
[0006]其中，N
‑
F1的核苷酸序列为TTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAG；
[0007]N
‑
F2的核苷酸序列为TTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAAT；
[0008]N
‑
F3的核苷酸序列为ACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTG；
[0009]N
‑
F4的核苷酸序列为CTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTG；
[0010]N
‑
R1的核苷酸序列为TGTTAGCACCATAGGGAAGTCCAGCTTCTG；
[0011]N
‑
R2的核苷酸序列为CCTCAGTTGCAACCCATATGATGCCGTCTT；
[0012]N
‑
R3的核苷酸序列为CCAATGTGATCTTTTGGTGTATTCAAGGCT；
[0013]N
‑
R4的核苷酸序列为AGCACGATTGCAGCATTGTTAGCAGGATTGC；
[0014]所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为：
[0015]CTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGTGCTGCTTGACAGATTG。
[0016]进一步地，所述引物中N基因的反向引物用抗原标签[biotin]标记。
[0017]进一步地，所述探针的5
’
端修饰有抗原标记FAM，在距5
’
端约30nt序列位置上标记dSpacer(四氢呋喃，THF)，并且3
’
末端标记修饰基团c3spacer。
[0018]优选，所述正向引物的核苷酸序列为TTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAAT，所述反
向引物的核苷酸序列为[biotin]CCTCAGTTGCAACCCATATGATGCCGTCTT；所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为：
[0019][5
’
FAM]CTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTG[THF]TGCTGCTTGACAGATT G[c3spacer]。
[0020]本专利技术另一方面提供一种检测新型冠状病毒N基因的试剂盒，为用于重组酶聚合酶扩增技术结合侧向层析试纸条检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括溶解缓冲液、冻干酶粉、醋酸镁溶液、扩增产物稀释液、侧向层析试纸条、羊抗鼠单克隆抗体、抗所述SARS
‑
CoV
‑
2N基因抗原标签的单克隆抗体、上述引物和探针。
[0021]进一步地，所述溶解缓冲液包括30
‑
50mM Tris缓冲液、50
‑
150mM醋酸钾；所述冻干酶粉包括100
‑
500ng/μL重组酶、100
‑
400ng/μL重组酶辅因子、400
‑
900ng/μL单链DNA结合蛋白、50
‑
200ng/μL DNA聚合酶、50
‑
100ng/μL逆转录酶、1
‑
3mM ATP、30
‑
100mM磷酸肌酸、200
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300ng/μL肌酸激酶、200
‑
500μM dNTPs、5％
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10％w/v聚乙二醇20000、1
‑
5mM二硫苏糖醇。
[0022]进一步地，所述扩增产物稀释液为无酶水或Tris缓冲液。
[0023]采用上述试剂盒检测新型冠状病毒N基因的方法为：
[0024]1)配置反应体系，29.4μL溶解缓冲液，10μM正、反向引物各2.0μL，10μM探针0.6μL，待测模板DNA 2.0μL，无菌双蒸水11.5μL，共47.5μL；
[0025]2)将配置好的反应体系加入50mg冻干酶粉中，混匀，加入2.5μL 28mM醋酸镁溶液于管盖中，离心，恒温保持40℃反应20分钟进行RPA扩增；
[0026]3)在侧向层析试纸条上标记羊抗鼠的单克隆抗体、抗所述SARS
‑
CoV
‑
2N基因抗原标签的单克隆抗体；
[0027]4)取10μL步骤2)的RPA扩增产物，加入190μL扩增产物稀释液并混匀，在其中垂直插入侧向层析试纸条，5分钟之后观察结果。
[0028]本专利技术的试剂盒集成了重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧向流试纸条(LFD)检测，并有助于避免气溶胶污染。本专利技术LF
‑
RPA可视化检测方法耗时短、灵敏度高、特异性强，适用于对新型冠状病毒的现场快速筛查。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0030]本专利技术提供的用于重组酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测新型冠状病毒N基因的引物、探针，其特征在于：所述引物用于扩增新型冠状病毒N基因；所述探针用于检测新型冠状病毒N基因；所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物为N
‑
F1、N
‑
F2、N
‑
F3、N
‑
F4中的一种；所述反向引物N
‑
R1、N
‑
R2、N
‑
R3、N
‑
R4中的一种；其中，N
‑
F1的核苷酸序列为TTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAG；N
‑
F2的核苷酸序列为TTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAAT；N
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F3的核苷酸序列为ACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTG；N
‑
F4的核苷酸序列为CTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTG；N
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R1的核苷酸序列为TGTTAGCACCATAGGGAAGTCCAGCTTCTG；N
‑
R2的核苷酸序列为CCTCAGTTGCAACCCATATGATGCCGTCTT；N
‑
R3的核苷酸序列为CCAATGTGATCTTTTGGTGTATTCAAGGCT；N
‑
R4的核苷酸序列为AGCACGATTGCAGCATTGTTAGCAGGATTGC；所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针核苷酸序列为：CTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGTGCTGCTTGACAGATTG。2.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒N基因的引物、探针，其特征在于：所述引物中N基因的反向引物用抗原标签[biotin]标记。3.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒N基因的引物、探针，其特征在于：所述探针的5
’
端修饰有抗原标记FAM，在距5
’
端约30nt序列位置上标记dSpacer(四氢呋喃，THF)，并且3
’
末端标记修饰基团c3spacer。4.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒N基因的引物、探针，其特征在于：所述正向引物的核苷酸序列为TTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAAT，所述反向引物的核苷酸序列为[biotin]CCTCAGTTGCAACCCATATGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤殿琢，李进，陈皓，
申请(专利权)人：东北大学秦皇岛分校，
类型：发明
国别省市：