一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品制造技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，本发明专利技术提供了一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品，包括上游引物H5

【技术实现步骤摘要】
一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品。

技术介绍

[0002]H5亚型禽流感病毒为正粘病毒科，禽流感病毒A属，有囊膜，为单股正链RNA病毒，主要感染鸡、火鸡、鸭等。作为高致病性禽流感病毒，其对家禽养殖业造成了巨大经济损失。同时，作为人畜共患病，还严重威胁人类健康。作为一种传染性高、致病力强的高致病型禽流感病毒，对其进行早期诊断监测，从而降低大规模爆发的风险是重中之重。目前，用于H5亚型禽流感病毒检测的传统方法主要有病毒分离法、反转录多聚酶链式反应(RT
‑
PCR)、血凝和血抑试验(HA、HI)以及荧光定量PCR等。但由于病毒分离耗时长，不适于大规模检测，且需要BSL
‑
3实验室；RT
‑
PCR方法耗时长，荧光定量PCR方法仪器昂贵、需专业人员进行操作等满足不了快速准确地检测H5亚型禽流感病毒。因此，急需一种检测快速、灵敏度高、结果判断准确的H5亚型禽流感病毒检测方法。
[0003]重组酶辅助扩增技术(RAA)作为一种新型的等温扩增技术，因其具有耗时短，操作便携、特异性强，灵敏度高等特点被广泛应用于病毒、细菌和寄生虫的检测。RAA可在37～42℃恒温环境下，30min内实现病毒核酸的快速扩增。侧流层析试纸条技术(LFD)是一种便携式的辅助工具，被用于核酸、抗原、抗体的诊断，其结果肉眼可见。近年来，LFD与RAA结合被应用于新城疫病毒、非洲猪瘟病毒、新型冠状病毒、肺炎克雷伯菌等病原的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品，可在37～42℃条件下实现H5
‑
AIV核酸的快速检测，并使用试纸条可以实现在现场快速筛查H5
‑
AIV，为H5
‑
AIV的防控提供技术支撑。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组，包括上游引物H5
‑
F、下游引物H5
‑
R和探针H5
‑
P；
[0007]所述上游引物H5
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0008]所述下游引物H5
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]所述探针H5
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]作为优选，所述下游引物的5
′
端标记有生物素，所述探针的5
′
端标记有荧光基团，所述探针的3
′
端进行C3
‑
spacer封闭修饰。
[0011]本专利技术还提供了所述的引物探针组在制备检测H5
‑
AIV的产品中的应用。
[0012]作为优选，所述产品为侧流层析试剂盒或试纸条。
[0013]本专利技术还提供了一种检测H5
‑
AIV的侧流层析试剂盒，包括上游引物H5
‑
F、下游引
物H5
‑
R、探针H5
‑
P。
[0014]作为优选，所述试剂盒中还包括荧光缓冲液、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂和ddH2O；
[0015]所述荧光缓冲液(ABuffer)、乙酸镁溶液(B Buffer)、RAA干粉试剂来源于杭州众测生物科技有限公司的RT
‑
RAA核酸扩增试剂盒(荧光型)(S004ZC)。
[0016]本专利技术还提供了一种检测H5
‑
AIV的试纸条，包括样品结合垫、检测线和质控线。
[0017]作为优选，所述样品结合垫含有胶体金标记的FAM一抗，所述检测线含有链霉亲和素的生物素，所述质控线含有鼠抗FAM的FAM二抗。
[0018]本专利技术提供了一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组及其应用和含有该引物探针组的产品，包括上游引物H5
‑
F、下游引物H5
‑
R和探针H5
‑
P；所述上游引物H5
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物H5
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针H5
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本专利技术提供的可视化检测H5
‑
AIV的引物探针组合，可以特异性结合到H5
‑
AIV的RNA上，准确检测出H5
‑
AIV，且与禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，对H5
‑
AIV的最低检测限为1copies/μL，能够实现H5
‑
AIV的早期快速诊断，同时，检测的准确度高，用时短，在37℃恒温条件下快速扩增，仅需15min就可以达到检测水平，且无需特殊仪器和专业操作人员，达到了快速检测H5
‑
AIV的目的，对H5
‑
AIV的防控具有重要意义，对维护公共安全提供了一种技术支撑。
附图说明
[0019]图1是本专利技术实施例RT
‑
RAA
‑
LFD检测方法在不同温度条件下的检测结果图；
[0020]图2是本专利技术实施例RT
‑
RAA
‑
LFD检测方法在不同反应时间条件下的检测结果图；
[0021]图3是本专利技术实施例RT
‑
RAA
‑
LFD检测方法特异性检测结果图；
[0022]图4是本专利技术实施例RT
‑
RAA
‑
LFD检测方法灵敏度检测结果图；
[0023]图5是荧光定量PCR检测方法灵敏度测试结果图。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0025]实施例1材料与方法
[0026]1.病毒样品及试剂盒
[0027]H3、H5、H7、H9
‑
AIV、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、A群轮状病毒(RVA)、鸭星状病毒(DAstV)。
[0028]病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒：济凡生物科技(北京)有限公司。
[0029]RT
‑
RAA核酸扩增试剂盒、侧流层析试纸条：杭州众测生物科技有限公司。
[0030]2.引物和探针的设计
[0031]根据H5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化检测H5亚型禽流感病毒的引物探针组，其特征在于，包括上游引物H5
‑
F、下游引物H5
‑
R和探针H5
‑
P；所述上游引物H5
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物H5
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针H5
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述下游引物的5
′
端标记有生物素，所述探针的5
′
端标记有荧光基团，所述探针的3
′
端进行C3
‑
spacer封闭修饰。3.权利要求1或2所述的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，尚佳静，蒋文明，于晓慧，尹馨，张富友，邓春冉，罗娟，刘华雷，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：