本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及引物探针组及其应用、试剂盒及检测方法。本发明专利技术以南方水稻黑条矮缩病毒编码的CP基因特定保守序列为模板，设计特定引物和探针。采用本发明专利技术的引物和探针进行检测南方水稻黑条矮缩病毒，仅需以水稻病叶RNA为模板，进行等温扩增，不需要精密仪器，操作简单，结果可视化，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，敏感性高，特异性强，诊断准确，整个检测过程只需20分钟，结果的判定极其简便，适用于南方水稻黑条矮缩病毒的田间快速检测。快速检测。
【技术实现步骤摘要】
引物探针组及其应用、试剂盒及检测方法
[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及引物探针组及其应用、试剂盒及检测方法。
技术介绍
[0002]南方水稻黑条矮缩病(Southern rice black
‑
streaked dwarf virus，SRBSDV，Genus Fijivrus)又称“矮缩病”或“矮仔禾”，是一种病毒病，主要是通过白背飞虱(Sogatella furcifera)为传毒媒介进行传播。白背飞虱通过取食患病植株获得病毒，该病毒可在其体腔和唾液腺中大量繁殖，一旦获毒则会拥有终身传毒的能力。随着白背飞虱的迁飞进而扩散进健康水稻植株中。南方水稻黑条矮缩病在水稻整个生民期内都能发生，且侵染危害越早，则发病越早，对水稻的危害就会越大。其侵染后会造成水稻严重矮化，分孽增多，水稻不抽穗或穗小，严重影响水稻产量和品质。因此，建立高效、快速、实用的南方水稻黑条矮缩病毒检测技术，对南方水稻黑条矮缩病毒的防控具有重要的意义。
[0003]目前，检测水稻病毒的检测方法主要有植物指示法、酶联免疫吸附法、PCR技术、环介导、等温扩增LAMP等。指示植物检测法，方法简单，但是无法确定侵染病毒的种类，灵敏度也较低。目前，已有很多利用血清学检测方法鉴定水稻病毒的报道，其中以酶联免疫吸附法最为普遍。该方法：灵敏度高、快速直观、可大量检测水稻病毒但是耗时较长，费用较高、对复合感染样品不够灵敏、假阳性较强。利用分子生物学技术建立的普通PCR、(RT)PCR技术等方法使得水稻病毒的检测操作简单，灵敏可靠，但对操作人员有一定的要求，且需要配备昂贵的仪器，限制了田间使用。等温扩增LAMP，可适用于田间检测，但引物设计繁琐，检测过程中易受气溶胶污染，导致结果出现假阳性。
[0004]重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication，RPA)是由Piepenburg等于2006年研发的一种新型核酸等温扩增技术是依赖重组酶、单链RNA结合蛋白和链置换RNA聚合酶完成对模板RNA指数型扩增的一种快速灵敏的核酸恒温扩增技术，该技术与利用胶体金免疫层析原理检测的侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合应用，实现检测结果可视化。
[0005]该技术不借助大型仪器设备，无需温度循环，通过模拟生物体内RNA复制，在恒定温度下，短暂时间内，实现目标片段扩增。该技术具有快速、经济有效、操作性强、特异性强和敏感性高等优点被广泛应用到动植物病原菌检测。目前，国内外尚未有将该技术用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的报道。因此，提供能够检测南方水稻黑条矮缩病毒的RT
‑
RPA引物和探针、试剂盒及检测方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
[0006]有鉴于此，本专利技术提供的检测南方水稻黑条矮缩病毒的RT
‑
RPA引物和探针、试剂盒及检测方法，结合侧流层析试纸条可实现南方水稻黑条矮缩病毒的高效、快速、准确、特异性检测，整个检测过程只需20分钟，且结果的判定极其简便，适用于南方水稻黑条矮缩病毒的田间快速检测。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了引物组，包括引物1和引物2；
[0009]所述引物1具有：
[0010](1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0011](2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
[0012](3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
[0013]所述引物2具有：
[0014](4)、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
[0015](5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
[0016](6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
[0017]所述多个为2个至5个。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物组的所述引物2的5
’
端标记biotin。
[0019]本专利技术还提供了引物探针组，包括探针和上述引物组；
[0020]所述探针具有：
[0021](7)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
[0022](8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或
[0023](9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
[0024]所述多个为2个至5个。
[0025]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组中：
[0026]所述探针的5
’
端以荧光基团修饰；和/或
[0027]所述探针的第29位碱基与第30位碱基之间以THF连接；和/或
[0028]所述探针的3
’
端以C3
‑
Spacer修饰。
[0029]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组中：
[0030]所述引物2具有：
[0031](10)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或
[0032](11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或
[0033](12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
[0034]和/或
[0035]所述探针具有：
[0036](13)、如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或
[0037](14)、如(13)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(13)的相同或相似；或
[0038](15)、与如(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
[0039]所述多个为2个至5个。
[0040]本专利技术还提供了上述引物组或上述引物探针组在如下方面中的应用：
[0041](i)、制备南方水稻黑条矮缩病毒检测试剂和/或检测试剂盒；和/或
[0042](ii)、检测南方水稻黑条矮缩病毒；和/或
[0043](iii)、鉴别南方水稻黑条矮缩病。
[0044]本专利技术还提供了试剂，包括上述引物组或上述的引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。
[0045]本专利技术还提供了试剂盒，包括上述引物组、上述引物探针组或上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。
[0046]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述试剂盒还包括RPA酶、溶解剂、荧光扩增试剂、无菌水、反应驱动液、标准质粒、侧流层析试纸条中的一种或多种。
[004本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.引物组，其特征在于，包括引物1和引物2；所述引物1具有：(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述引物2具有：(4)、如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至5个。2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物2的5
’
端标记biotin。3.引物探针组，其特征在于，包括探针和如权利要求1或2所述的引物组；所述探针具有：(7)、如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至5个。4.如权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，包括：所述探针的5
’
端以荧光基团修饰；和/或所述探针的第29位碱基与第30位碱基之间以THF连接；和/或所述探针的3
’
端以C3
‑
Spacer修饰。5.如权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，包括：所述引物2具有：(10)、如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；或(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；和...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈文涛，庹德财，赵辉，孔华，郭安平，言普，唐清杰，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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