一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法技术

技术编号：41244494 阅读：4 留言：0更新日期：2024-05-09 23:55

本发明专利技术属植物生物学技术领域，涉及一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，是取棕榈科植物愈伤组织作为受体直接放入含有目标载体、农杆菌EHA105的侵染培养基中震荡侵染，然后将侵染后的受体接种至共培养基中暗培养1～3 d，获得瞬时转化材料。本发明专利技术以棕榈科植物愈伤组织为转化受体，采用农杆菌介导法将GUS/GFP基因经瞬时转化法导入愈伤组织中，获得瞬时转化材料，建立了一种适用于棕榈科植物愈伤组织瞬时转化体系，可以快速检测目的启动子或基因的表达情况，为后续建立农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织稳定转化技术奠定基础和提供技术参考。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属植物生物学，涉及一种农杆菌介导的愈伤组织瞬时转化方法，具体是一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法。

技术介绍

1、植物遗传转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法等多种方法，其中农杆菌介导的遗传转化具有转化频率高、见效快等优点，是目前植物基因转化中的主要方法之一，已在大豆、烟草、拟南芥等多种植物中使用。农杆菌介导的瞬时转化技术是将目标基因插入到t-dna区，通过农杆菌感染实现目标基因向植物细胞的转移，当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达和稳定表达两种。在瞬时表达状态的基因转移中，引入细胞的外源dna和宿主细胞染色体dna并不发生整合，这些 dna一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。

2、椰子（学名： cocos nucifera l.）和槟榔（学名： areca catechu l.）分别是棕榈科椰子属和槟榔属的常绿乔木，是热带和亚热带地区广泛种植的热带作物。由于不同植物的农杆菌介导的瞬时转化方法并不通用，且转化受体、农杆菌od600值、侵染时间、共培养等多种因素都会对椰子或槟榔瞬时转化的成功与否产生重要影响，目前，在农杆菌介导的椰子或槟榔愈伤组织瞬时传转化方面的研究尚处于起步阶段。经检索，未见有关遗传转化方法，特别是农杆菌介导法在椰子和槟榔中使用的相关报道。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是提供一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬

2、本专利技术所采用的技术方案：

3、一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，包括以下步骤：

4、步骤s1：侵染培养基的制备：将od600值为0.5～0.8的农杆菌eha105菌液离心，弃上清液，添加悬浮培养基重悬菌体，震荡培养，得到od600值为0.5～1.0的侵染培养基。所述悬浮培养基：磷酸氢二钾1～3g/l+磷酸氢二钠1～3g/l+氯化铵1～3g/l+七水硫酸镁0.1～1g/l+mes 10～15g/l+乙酰丁香酮40～100 mg/l+葡萄糖20～50g/l。

5、步骤s2：取棕榈科植物愈伤组织作为受体，除去残留培养基后直接放入含有目标载体的侵染培养基中侵染。所述棕榈科植物是椰子或槟榔。

6、步骤s3：将侵染后的受体接种至共培养基中暗培养1～3 d，获得瞬时转化材料。所述共培养基：y3培养基+6-苄氨基嘌呤1～5mg/l+吲哚丁酸1～5 mg/l+乙酰丁香酮 40～100mg/l+蔗糖20～50 g/l+琼脂粉6～10 g/l。

7、优选的，所述愈伤组织为新诱导的、活力旺盛的愈伤组织。

8、优选的，所述侵染为通过摇床震荡侵染，摇床温度28～30 ℃，转速80～100 r/min；侵染完成后在滤纸上的干燥时间为0.5～1小时。

9、优选的，所述侵染的时间为20～30 min。

10、优选的，所述目标载体是指含有目标基因的pun1301载体；所述目标基因包括gus或gfp基因。

11、进一步的，还包括以下步骤：暗培养1～3d后，采用组织化学gus染色法或荧光显微镜观察鉴定转化结果。

12、与现有技术相比，本专利技术的有益成果在于：

13、本专利技术以棕榈科植物愈伤组织为转化受体，采用农杆菌介导法将gus/gfp基因经瞬时转化法导入愈伤组织中，获得瞬时转化材料，从而建立了一种适用于棕榈科植物愈伤组织瞬时转化体系，可以快速检测目的启动子或基因在椰子或槟榔愈伤组织细胞中的表达情况，还可利用组织化学gus染色法或荧光显微观测法初步筛选出阳性材料，为后续建立农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织稳定转化技术奠定基础和提供技术参考。

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【技术保护点】

1.一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于：所述愈伤组织为新诱导的、活力旺盛的愈伤组织。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于：所述侵染为通过摇床震荡侵染，摇床温度28～30 ℃，转速80～100 r/min；侵染完成后在滤纸上的干燥时间为0.5～1小时。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于：所述侵染的时间为20～30 min。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于：所述目标载体是指含有目标基因的pUN1301载体；所述目标基因包括GUS或GFP基因。

6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于：暗培养1～3d后，采用组织化学GUS染色法或荧光显微镜观察鉴定转化结果。

【技术特征摘要】

1.一种农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的棕榈科植物愈伤组织瞬时转化方法，其特征在于：所述愈伤组织为新诱导的、活力旺盛的愈伤组织。

4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大鹏，王永，石鹏，李志瑛，尹敏慧，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院三亚研究院，
类型：发明
国别省市：

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