本发明专利技术提供了同时突变橡胶树HbMLO14和HbMLO23基因的编辑靶点、基因编辑载体和应用。同时突变橡胶树HbMLO14和HbMLO23基因的编辑靶点，所述编辑靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过对橡胶树中2个候选的感白粉病基因HbMLO14及HbMLO23进行序列比对，在两个基因编码区的序列一致处设计了sgRNA靶点，因而可以做到同时突变HbMLO14及HbMLO23两个基因，相比于突变一个候选感病基因，同时突变2个基因有望对白粉病表现出更强、更广谱的抗性。
1、橡胶树白粉病是我国橡胶生产面临的头号病害，该病可造成高达45％以上的产量损失，每年必须投入大量的人力、物力、财力进行白粉病防治，所以培育高产、抗病的新品种是橡胶树育种的重要目标之一，突变植物中感病的mlo基因是培育抗白粉病品种的通用方法。在橡胶树中，hbmlo23已经被证明为感病的mlo基因，而hbmlo14为候选感病基因，突变掉这两个基因有望能创制出橡胶树抗白粉病品种。
2、之前受橡胶树遗传转化和基因编辑技术瓶颈限制，橡胶树hbmlo基因的研究还停留在鉴定、克隆、表达、异源转化或瞬时转化鉴定阶段，无法用敲除或编辑等技术手段进行橡胶树体内功能研究，既不能精确地鉴定hbmlo基因的功能，也无法通过丧失hbmlo的功能创制出抗病的新种质。
3、hbmlo作为感白粉病基因，对其进行功能丧失突变是鉴定其功能及培育抗病品种的必由之路。2023年，海南大学繆卫国团队通过叶片瞬时转化的方法对hbmlo23的mrna进行rnai干涉，首次完成hbmlo基因的体内功能鉴定。但是这种方法存在以下不足：一是干涉不彻底，无法做到完全丧失hbmlo基因的功能；二是，hbmlo是包含多个同源基因的基因家族，rnai干涉的特异性不高，造成hbmlo基因鉴定的特异性和精确性较差。三是，该研究并没有对与hbmlo23高度同源的hbmlo14基因进行突变，所以遗漏了突变hbmlo14对抗病的贡献程度。
r/>技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因的编辑靶点、基因编辑载体和应用，能够同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因的编辑靶点，所述编辑靶点的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术还提供了一种同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因的基因编辑载体，所述基因编辑载体的制备方法包括：
5、1)将mlo-both-f正向引物和mlo-both-r反向引物退火，得到双链靶标序列；
6、所述mlo-both-f正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述mlo-both-r反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；
7、2)将所述步骤1)得到的双链靶标序列连接到hbu6.2-163cas9m载体中，得到基因编辑载体；
8、所述hbu6.2-163cas9m载体的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9、优选的，所述步骤1)退火的条件包括：温度为100℃，时间为5min。
10、优选的，所述步骤2)hbu6.2-163cas9m载体经aari酶酶切后再与双链靶标序列连接；
11、所述酶切的体系包括：10×aari buffer 5μl、50×oligonucleotide 1μl、aari1μl、hbu6.2-163cas9m载体1μg，ddh2o补至50μl；
12、所述酶切的条件包括：温度为37℃，时间为5h。
13、优选的，所述步骤2)连接的体系包括：hbu6.2-163cas9m载体50ng、10×t4 ligasebuffer 1μl、双链靶标序列7μl、t4连接酶0.5μl，补足ddh2o至10μl；
14、所述连接的条件包括：温度为20～30℃，时间为1h。
15、本专利技术还提供了上述技术方案所述的编辑靶点在同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因中的应用。
16、本专利技术还提供了上述技术方案所述的基因编辑载体在同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因中的应用。
17、优选的，所述应用包括：将所述基因编辑载体通过peg介导法转入橡胶树原生质体。
18、优选的，所述peg介导法包括以下步骤：
19、a、将所述基因编辑载体与橡胶树原生质体悬液混合、静置，得到静置物；
20、b、将所述得到的静置物与等体积的peg溶液混合、黑暗静置，实现同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因。
21、优选的，所述基因编辑载体的质量与橡胶树原生质体悬液的体积比为50μg:1ml；所述橡胶树原生质体悬液的浓度为5×106个/ml；所述静置的时间为15min；
22、所述peg溶液的质量百分含量为40％；所述黑暗静置的温度为28℃，时间为15min。
23、本专利技术的有益效果为：
24、crispr/cas9基因编辑技术具有高效、特异、能彻底突变目的基因的功能，目前国内外关于橡胶树基因编辑技术的报道仅限于本团队，本专利技术是首次运用该技术对hbmlo基因进行研究，想比于之前的技术，该技术可以对hbmlo基因完成彻底的功能丧失突变。在本专利技术中，通过对橡胶树中2个候选的感白粉病基因hbmlo14及hbmlo23进行序列比对，在两个基因编码区的序列一致处设计了sgrna靶点，因而可以做到同时突变hbmlo14及hbmlo23两个基因，相比于突变一个候选感病基因，同时突变2个基因有望对白粉病表现出更强、更广谱的抗性。
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【技术保护点】
1.同时突变橡胶树HbMLO14和HbMLO23基因的编辑靶点，其特征在于，所述编辑靶点的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种同时突变橡胶树HbMLO14和HbMLO23基因的基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体的制备方法包括：
3.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，所述步骤1)退火的条件包括：温度为100℃，时间为5min。
4.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，所述步骤2)HbU6.2-163Cas9M载体经AarI酶酶切后再与双链靶标序列连接；
5.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，所述步骤2)连接的体系包括：HbU6.2-163Cas9M载体50ng、10×T4 ligase buffer 1μL、双链靶标序列7μL、T4连接酶0.5μL，补足ddH2O至10μL；
6.权利要求1所述的编辑靶点在同时突变橡胶树HbMLO14和HbMLO23基因中的应用。
7.权利要求2～5任一项所述的基因编辑载体在同时突变橡胶树HbMLO14和HbMLO23基因中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述基因编辑载体通过PEG介导法转入橡胶树原生质体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述PEG介导法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基因编辑载体的质量与橡胶树原生质体悬液的体积比为50μg:1ml；所述橡胶树原生质体悬液的浓度为5×106个/ml；所述静置的时间为15min；
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【技术特征摘要】
1.同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因的编辑靶点，其特征在于，所述编辑靶点的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种同时突变橡胶树hbmlo14和hbmlo23基因的基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体的制备方法包括：
3.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，所述步骤1)退火的条件包括：温度为100℃，时间为5min。
4.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，所述步骤2)hbu6.2-163cas9m载体经aari酶酶切后再与双链靶标序列连接；
5.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，所述步骤2)连接的体系包括：hbu6.2-163cas9m载体50ng、10×t4 ligase buffer ...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨先锋，王笑一，黄天带，林秋飞，戴雪梅，彭素娜，辛士超，邓玉婷，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院三亚研究院，
类型：发明
国别省市：
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