【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业、渔业、水产养殖、水产养殖病害防控，具体而言，涉及检测ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的raa-crispr检测试剂盒。
技术介绍
1、草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，gcrv)，隶属于呼肠孤病毒科(reoviridae)水生呼肠孤病毒属(aquareovirus)成员，是我国分离的第一株鱼类病毒。该病毒为双链rna病毒，是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，直径55-82nm，基因组由11个dsrna节段组成，依据病毒基因序列及毒株带型分析可以分为三种基因型：gcrv-ⅰ，gcrv-ⅱ和gcrv-ⅲ。
2、gcrv引起草鱼在鱼种阶段暴发出血病，流行范围较广、发病流行季节较长(6月至9月)、死亡率可高达90％，严重危害草鱼养殖业。依据出血部位的不同可将该病分为3种类型：分别是以肌肉严重充血或出血的肌肉出血型；以鳃盖、鳃基、头顶、口腔、眼眶充血或出血的红鳍红鳃盖型以及以肠道充血或出血的肠炎型。草鱼出血病的三种典型充血或出血症状可单独出现，亦可混合出现。《2021中国水生动物卫生状况报告》(中国农业出版社)数据指出，“全国监测养殖场点360个其中阳性场57个，平均阳性养殖场点检出率为15.8％。从阳性样品种类来看，20省(自治区、直辖市)共采集样品388批次，检出阳性样品61批次，平均阳性样品检出率为15.7％，2020年监测结果显示，该疾病病原草鱼呼肠孤病毒的阳性检出率为近年来最高”，卫生状况报告同时指出“加强对草鱼、青鱼等敏感宿主的主动监测”，及时对带病宿主检出与清除是行之有
3、目前针对草鱼呼肠孤病毒的检测已建立了多种方法，其中最早建立的且最直观有效的是电镜观察和细胞培养。但电镜观察对仪器设备要求较高，并且样品处理过程复杂，而细胞培养需要多次传代感染，所需时间长，并且针对目前不同基因型的分离株的细胞培养特点，gcrv毒株并不能在细胞上完全出现cpe，不能直观观察。(张可.一株新型草鱼呼肠孤病毒的分离鉴定及其rpa-lfd检测方法的建立[d].上海海洋大学,2022.)
4、pcr技术目前是公认核酸检测技术中的“金标准”，但该技术需借助pcr仪器、荧光pcr仪等仪器开展检测工作，此技术虽成熟稳定，但无法脱离实验室硬件设备支持，不利于大范围推广使用。常规pcr检测技术整体反应时长通常在3h左右。(曾伟伟,王庆,王英英等.草鱼呼肠孤病毒三重pcr检测方法的建立及其应用[j].中国水产科学,2013,20(02):419-426.)荧光定量pcr技术整体反应时间较常规pcr技术时间更短，大约在1.5h左右，最低检测限也更低，可达4copies/μldna(殷亮,王庆,曾伟伟等.基因ⅰ型草鱼呼肠孤病毒taqmanreal-time pcr检测方法的建立及应用[j].水产学报,2014,38(04):569-575.)。多重pcr技术可在一组反应内同时识别并检测多种不同基因型的gcrv病毒，整体反应时间与常规pcr反应接近，但通量较常规pcr技术更高，针对gcrv-ⅱ的最低检测限可达250copies/μl dna(范玉顶,马杰,周勇等.不同基因型草鱼呼肠孤病毒通用rt-pcr检测方法的建立及应用[j].淡水渔业,2018,48(06):9-16.)。
5、lamp和rpa等技术因为不需要变温扩增仪器(如pcr仪器、定量pcr仪器)，同时可以利用颜色反应或恒温扩增仪器(如普通水浴锅、专用恒温扩增仪器等)更适用于农业一线和条件相对简单的基层养殖场开展相应工作。
6、环介导等温扩增(lamp)技术方法，为恒温反应，在63℃恒温条件1.3h内完成反应，直接观察颜色变化；检测gcrv-ⅱ型cdna的最低检出限为33pg，检测全过程约1小时(张金凤,曾令兵,张辉等.草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(rt-lamp)检测方法的建立[j].中国水产科学,2013,20(01):129-136.)。
7、重组酶聚合酶扩增(rpa)快速检测方法，提取dna后rpa、反应时间约15min。
8、raa法主要使用3种酶：重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶。重组酶与引物结合形成复合体，在单链dna结合蛋白的辅助下，模板dna解链并使引物与模板配对，然后在dna聚合酶的作用下，生成新的dna链。经过几十个循环后，dna新链的数量以指数级增长。raa法用酶的作用使双链dna解链。因此反应条件较温和，不需要高温使模板dna变性。raa反应的时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段。重组酶介导扩增(raa技术)相较于重组酶聚合酶扩增(rpa技术)的技术改进在于：(1)raa扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物聚合体；rpa使用的重组酶是t4 uvsx，来自于病毒。实验证明，来自于细菌和真菌的重组酶能与dna紧密结合，使核酸体外扩增反应顺利进行。(2)raa使用的聚合酶只具有dna聚合酶活性，反应产物呈指数级增长；rpa的聚合酶具有链置换活性和聚合酶活性，反应产物不呈指数增长。
9、cas12a可用于编辑目标dna。该蛋白最初被称为cpf1，由张锋团队在其2015年的cell论文中首次提出。cas12a(cpf1)是基因编辑酶家族的重要一员，它能够在cas9不能作用的位置切割dna；与crrna以及靶标dna形成三元复合物，该复合物就会表现出很强的反式核酸酶活性活性，可将体系中非靶标单链dna切成几个碱基长度的“碎片”。利用这一特性，doudna教授团队开发出一种被称为“detectr”(dna endonuclease targeted crisprtrans reporter)的诊断系统，该系统由crispr-cas12a(cpf1)和向导rna、荧光报告分子及rpa(recombinase polymerase amplification)等温扩增试剂组成，单管反应即可对临床样本中的少量dna进行快速、简便地即时检测。当加热到一定温度时，rpa扩增目标dna，使cas12a(cpf1)更容易找到并切割它，然后激活cas12a(cpf1)的核酸酶活性使其切割体系中的其它单链dna(也就是荧光报告分子)，从而发出荧光。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种多相快速检测ii型草鱼呼肠孤病毒的检测溶液体系、制备方法、检测方法及应用，旨在进一步提升一线临床检疫的效率与准确度。
2、为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提出了一种多相快速检测ii型草鱼呼肠孤病毒的检测溶液体系，所述检测溶液体系用于检测ii型草鱼呼肠孤病毒，其中，所述检测溶液体包括raa扩增溶液体系以及位于其上层的crispr检测体系，所述raa扩增溶液体系中含有raa扩增试剂和蔗糖，蔗糖初始浓度为15～40wt％，所述raa扩增溶液体系所采用的引物对为下列引物对的其中之一：
3、引物对a：上游引物序列如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多相快速检测II型草鱼呼肠孤病毒的检测溶液体系，其特征在于，所述检测溶液体系用于检测II型草鱼呼肠孤病毒，其中，所述检测溶液体包括RAA扩增溶液体系以及位于其上层CRISPR检测体系，所述RAA扩增溶液体系中中含有RAA扩增试剂和蔗糖，蔗糖初始浓度为15～40wt％，所述RAA扩增溶液体系中还含有下列引物对的其中之一：
2.根据权利要求1所述的检测溶液体系，其特征在于，所述RAA扩增溶液体系与CRISPR检测体系的体积比为1：(2～9)。
3.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述RAA扩增溶液体系还含有待测样品。
4.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述RAA扩增试剂含有如下试剂中的一种或多种：
5.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述CRISPR检测体系含有如下的一种或多种：
6.一种制备如权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
7.一种多相快速检测II型草鱼呼肠孤病毒的检测方法，其特征在于，
8.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤S3中具体包括如下步骤：
9.如权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系在非诊断目的的应用，其特征在于，所述应用为如下的任一种或多种：
10.一种原料套装组合物，其包含原料套装盒A和原料套装盒B，其中，所述原料套装盒A含有用于配制权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系中的RAA扩增溶液体系的原料，所述原料套装盒B含有用于配制权利要求1～5中任意一项所述的检测溶液体系中的CRISPR检测体系的原料，其他试剂包括引物对A-E中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种多相快速检测ii型草鱼呼肠孤病毒的检测溶液体系，其特征在于，所述检测溶液体系用于检测ii型草鱼呼肠孤病毒，其中，所述检测溶液体包括raa扩增溶液体系以及位于其上层crispr检测体系，所述raa扩增溶液体系中中含有raa扩增试剂和蔗糖，蔗糖初始浓度为15～40wt％，所述raa扩增溶液体系中还含有下列引物对的其中之一：
2.根据权利要求1所述的检测溶液体系，其特征在于，所述raa扩增溶液体系与crispr检测体系的体积比为1：(2～9)。
3.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述raa扩增溶液体系还含有待测样品。
4.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述raa扩增试剂含有如下试剂中的一种或多种：
5.根据权利要求1或2所述的检测溶液体系，其特征在于，所述crispr检测体系含有如下的一种或多种：
6.一种...
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