一种人源化的鼠抗人B7-H3单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种人源化的鼠抗人B7

【技术实现步骤摘要】
一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体及其制备方法、肿瘤抑制功能以及功能阻断位点。

技术介绍

[0002]B7
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H3于2001年从人树突状细胞cDNA文库中首次克隆出来。早期的B7
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H3被认为是一种正性共刺激分子，能够正性调控T细胞产生免疫活化效应。但随着研究的深入，越来越多的研究显示B7
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H3更多地展现出负性共刺激分子的效应，包括抑制Th1细胞活性，促进免疫抑制细胞因子产生，促进肿瘤免疫逃逸等。遗憾的是，B7
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H3的受体至今尚未发现。曾有研究发现TLT
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2可以作为B7
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H3的受体发挥功能，但存在争议，并且也应该不是唯一的受体，因为B7
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H3具有正性和负性的双重作用，很可能通过不同受体发挥功能。除了受体的研究，B7
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H3还被发现可以与一些结合蛋白，如I L20RA，MVP等结合发挥生物学功能。
[0003]此外，B7
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H3的非免疫学效应最近也越来越多地受到关注。不仅在骨分化、炎症反应以及代谢等多种疾病和功能中B7
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H3都扮演非免疫功能的角色，在肿瘤细胞中B7
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H3也可以不依赖于免疫效应而独立地通过调控肿瘤细胞生物信号发挥功能。B7
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>H3可以通过多种信号途径直接参与多种肿瘤细胞的肿瘤进展、化疗药物敏感性以及糖酵解，包括PI 3K/Akt、Jak/STAT、NF
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κB
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p65/MAPK
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p38和Ras/Raf/MEK等信号。B7
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H3能够在多种癌症类型的肿瘤患者组织中检测到并异常表达，并预测预后不良，因此B7
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H3可以作为一个候选的癌症治疗靶点。
[0004]到目前为止，针对B7
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H3作为肿瘤治疗靶点，已有3种具有ADCC或ADC作用的抗B7
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H3的单克隆抗体正在进行至少11项一期临床试验，并取得了相当不错的初步结果。此外，B7
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H3已被广泛地用作CAR
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T细胞(B7
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H3.CAR
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Ts)的作用靶点，在体外和小鼠体内有效地控制肿瘤细胞，且无明显毒性。尽管受体尚未阐明，B7
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H3由于其独特的功能吸引了越来越多地基础和临床研究。
[0005]因此，研制人源化鼠抗人B7
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H3单克隆抗体可以为进一步研究该分子在肿瘤中的作用奠定物质基础，阻断位点的阐明也为探明B7
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H3信号传导通路及功能机制提供可能的解释，具有肿瘤生长抑制功能的抗人B7
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H3单抗有望成为肿瘤生物治疗的关键药物。

技术实现思路

[0006]本申请的主要目的在于提供一种可阻断B7
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H3与原癌基因c
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Met结合，且能抑制荷瘤小鼠体内肿瘤生长的人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体及其应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体，包括重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL)，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0009]所述SEQ ID NO.1的序列为：
[0010]QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYPIHWVKQSPGQGLEWIARI YWGIDSIYYNEIFRGKVTLTADTSTSTAYMQLSSLKSEDTAVYFCANSGYTDYGT YYLMDYWGQGTTVTVSS；
[0011]所述SEQ ID NO.2的序列为：
[0012]DIVMTQSALSVSVTPGESVSISCRSTRSLLHSNGCTYLYWFLQRPGQSPQLLIY WMYNLASGVPDRFSGSGSGTTFTLKISRVEAEDVGVYYCMSNLEYLFTFGGGTK LEIK。
[0013]上述一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体，作为一种优选的实施方案，所述重链可变区具有三个高变区，具体为：GYTFTNYP(SEQ ID NO.3)、IYWGIDSI(SEQ ID NO.4)、ANSGYTDYGTYYLMDY(SEQ ID NO.5)。
[0014]上述一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体，作为一种优选的实施方案，所述轻链可变区具有三个高变区，具体为：
[0015]RSTRSLLHSNGCTYLY(SEQ ID NO.6)、WMYNLA(SEQ ID NO.7)、MSNLEYLFT(SEQ ID NO.8)。
[0016]本专利技术的第二方面，提供一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体在重链可变区和轻链可变区的检测方法，包括如下步骤：
[0017](1)制备B7
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H3单克隆抗体的杂交瘤；
[0018](2)制备B7
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H3鼠/人嵌合抗体：
[0019](2.1)提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT
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PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA，进一步PCR获得单抗重链可变区和轻链可变区；
[0020](2.2)将步骤2.1所述重链可变区和轻链可变区分别与克隆载体pJET连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄抗性基因，将转化菌液涂在氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养基上，37
°
过夜培养；
[0021](2.3)待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定重链和轻链可变区基因序列；
[0022](2.4)根据测序结果保留候选的重链可变区和轻链可变区序列，再次PCR扩增出与表达载体匹配的重链可变区和轻链可变区序列，将PCR产物与BmtI(酶切位点GCTAG^C)，FspI(酶切位点TGC^GCA)限制性内切酶预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性的LB固体培养基上，37
°
过夜培养；
[0023](2.5)对比两次测序结果，测试方法参照(2.4)，挑选前后两次序列均一致的转化菌，，扩大培养后进行质粒抽提；将包含了单抗重链可变区和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SEQ ID NO.1的序列为：QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYPIHWVKQSPGQGLEWIARI YWGIDSIYYNEIFRGKVTLTADTSTSTAYMQLSSLKSEDTAVYFCANSGYTDYGT YYLMDYWGQGTTVTVSS；所述SEQ ID NO.2的序列为：DIVMTQSALSVSVTPGESVSISCRSTRSLLHSNGCTYLYWFLQRPGQSPQLLIY WMYNLASGVPDRFSGSGSGTTFTLKISRVEAEDVGVYYCMSNLEYLFTFGGGTK LEIK。2.根据权利要求1所述一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区具有三个高变区，具体为：GYTFTNYP、IYWGIDSI、ANSGYTDYGTYYLMDY。3.根据权利要求1所述一种人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区具有三个高变区，具体为：RSTRSLLHSNGCTYLY、WMYNLA、MSNLEYLFT。4.权利要求1
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3任意一项所述的人源化的鼠抗人B7
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H3单克隆抗体在重链可变区和轻链可变区的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备B7
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H3单克隆抗体的杂交瘤；(2)制备B7
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H3鼠/人嵌合抗体：(2.1)提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT
‑
PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA，进一步PCR获得单抗重链可变区和轻链可变区；(2.2)将步骤2.1所述重链可变区和轻链可变区分别与克隆载体pJET连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄抗性基因，将转化菌液涂在氨苄青霉素抗性的LB固体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，曹磊，傅丰庆，
申请(专利权)人：苏州旭光科星抗体生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：