GFRAL的单域抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体地，本发明专利技术涉及GFRAL的抗体或其应用。本发明专利技术提供针对GFRAL靶点的重链抗体，该抗体与GFRAL特异性结合，并阻断GFRAL与GDF15的相互作用，可以用来治疗与GDF15

【技术实现步骤摘要】
GFRAL的单域抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及GFRAL的抗体或其应用。更具体地，本专利技术涉及能够特异性识别GFRAL的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途以及检测GFRAL的试剂盒。

技术介绍

[0002]GDNF
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family receptorα
‑
like，GFRAL(也称为GRAL)属于胶质细胞源性神经营养因子(Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor，GDNF)家族α样受体。GFRAL基因定位于人6号染色体，含有9个外显子，且存在可变剪切体。GFRAL是一种I型跨膜蛋白，分子量约为44kDa(Breit等人，Annual Review of Physiology 83(2021):127
‑
151)。
[0003]2017年发表的文章公布了受体蛋白GFRAL的发现(Yang L等人，Nat Med,2017,23:1158
‑
1166)，它是GDF15新型且高度特异性的受体，是具有短细胞质结构域的跨膜蛋白，在中枢神经系统的黑质、海马和后部区域相对富集(Li Z等人，J Neurochem,2005,95:361
‑
376)。
[0004]有实验表明，GFRAL与GDF
‑
15可结合神经元表面的受体酪氨酸激酶RET形成复合物，产生的GDF15
‑r/>GFRAL
‑
RET信号通路轴共同介导的下游信号的反应，打开身体能量代谢通路，参与许多病理生理过程。越来越多的研究发现，GFRAL有望作为严重肥胖(Mullican等人，Trends in Endocrinology&amp；Metabolism 29.8(2018):560
‑
570.)、厌食症(Tsai等人，International Journal of Obesity 43.12(2019):2370
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2380)、肿瘤相关恶病质(Assadi等人，Pfl
ü
gers Archiv
‑
European Journal of Physiology(2020):1
‑
12)治疗的潜在靶标。
[0005]在GFRAL单克隆抗体方面开展的工作包括：NGM公司(CN109715206A)开发的3P10和25M22，是一种结合GFRAL并抑制GDF15信号的拮抗剂抗体，主要通过抑制GDF15
‑
GFRAL
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RET复合物形成来发挥作用，其主要适应症为转移性胰腺癌等癌症和恶病质。
[0006]但目前公开的GFRAL抗体的种类较少，特异性仍有待改善。

技术实现思路

[0007]本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0008]重链单域抗体优势：(1)分子量小，组织穿透力强，广泛应用于肿瘤诊断治疗和分子影像等；(2)结构简单，易于进行基因工程改造；(3)制备简单，工业化放大生产成本低周期短；(4)稳定性高，易储存，可耐受高温、强酸、强碱等致变性条件；(5)特异性好。目前公开的GFRAL抗体的种类较少，尚无针对GFRAL靶点的重链单域抗体报道，
[0009]本专利技术的专利技术人利用人GFRAL蛋白免疫羊驼，采集免疫后的羊驼的外周血细胞，从中分离GFRAL的亲和淋巴细胞，提取总RNA，采用巢式PCR技术克隆羊驼重链抗体的重链抗体可变区片段，将其插入到噬菌体质粒中，构建噬菌体表达文库，接着通过噬菌体展示技术对GFRAL抗体进行多轮筛选，最后将筛选获得的高亲和抗体在原核细胞进行大量表达纯化，并
经酶联免疫吸附试验(ELISA)对所获得的单域抗体的结合活性进行验证。成功筛选出了具有高亲和活性的GFRAL单域抗体。
[0010]本专利技术提供针对GFRAL靶点的重链抗体，该抗体与GFRAL特异性结合，并阻断GFRAL与GDF15的相互作用，阻断GDF15
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GFRAL
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RET复合物的形成，从而抑制GDF15
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GFRAL
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RET信号通路轴介导的下游信号的反应，所述重链抗体可以用于治疗与GDF15
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GFRAL
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RET信号通路轴相关的疾病。本专利技术提供了首个针对GFRAL靶点的重链抗体，亲和力优于阳性对照3P10及25M22，阻断活性优于阳性对照25M22，特异性优于阳性对照25M22。
[0011]为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种能够特异性识别GFRAL的抗体或其抗原结合片段。根据本专利技术的实施方案，所述抗体包括：
[0012](i)具有SEQ ID NO:1
‑
6所示重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述CDR1、CDR2和CDR3按照IMGT定义方式、Kabat定义方式、Chothia定义方式、AbM定义方式或Contact定义方式确定；
[0013]或者与(i)相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。
[0014]本专利技术提供了一种新型的GFRAL重链单域抗体，这些抗体与GFRAL特异性结合，并抑制GDF15
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GFRAL
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RET复合物的下游信号通路，可以用来治疗与GDF15
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GFRAL
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RET轴相关联的疾病。
[0015]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种能够特异性识别GFRAL的抗体或其抗原结合片段。根据本专利技术的实施方案，所述抗体含有：
[0016]选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列：
[0017]重链可变区CDR序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。
[0018]TYNMG(SEQ ID NO：7)
[0019]TIRWSGGSTFYADSVKG(SEQ ID NO：8)
[0020]DRPLYIGSDYDRPSAYDY(SEQ ID NO：9)
[0021]TMRMA(SEQ ID NO：10)
[0022]AIGWSAGADYYADSVKG(SEQ ID NO：11)
[0023]DGIPLRVDVPASQANKYDY(SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够特异性识别GFRAL的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：(i)具有SEQ ID NO:1
‑
6所示重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述CDR1、CDR2和CDR3按照IMGT定义方式、Kabat定义方式、Chothia定义方式、AbM定义方式或Contact定义方式确定；或者与(i)相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。2.一种能够特异性识别GFRAL的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，含有：选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:13、14和15或者与SEQ ID NO:13、14和15具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:16、17和18或者与SEQ ID NO:16、17和18具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:19、20和21或者与SEQ ID NO:19、20和21具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:22、23和24或者与SEQ ID NO:22、23和24具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链框架区序列，所述重链框架区序列的至少一部分来自于骆驼源抗体、羊驼源抗体、鼠源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链框架区序列来自于羊驼源抗体。6.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ ID NO：1
‑
6任一项所示氨基酸序列的重链可变区。7.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链恒定区，所述重链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链恒定区来自于人源IgG抗体或其突变体。9.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：危喜玲，秦锁富，黄慧瑜，尚维，宋炜弘，张慧，
申请(专利权)人：科兴生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：