一种假尿苷工程菌及其应用、生产假尿苷的方法技术

一种产假尿苷工程菌，利用基因工程技术在宿主菌中敲除嘧啶生物合成途径相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌；所述宿主菌为大肠杆菌；敲除的所述嘧啶生物合成途径相关的基因为：pepA、thrA和argF基因；过量表达UDP，psuG、磷酸酶基因。UDP基因的蛋白序列为SEQIDNo55；所述psuG基因的蛋白序列为SEQIDNo56、SEQIDNo57、SEQIDNo58或者SEQIDNo59；所述磷酸酶基因的蛋白序列为SEQIDNo54、SEQIDNo60、SEQIDNo61、SEQID No62或者SEQIDNo63。所述菌株敲除psuK、psuT基因。psuK基因序列是SEQ IDNo22，psuT基因序列是SEQIDNo29。psuT基因序列是SEQIDNo29。psuT基因序列是SEQIDNo29。

【技术实现步骤摘要】
一种假尿苷工程菌及其应用、生产假尿苷的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种假尿苷工程菌及其应用、生产假尿苷的方法。

技术介绍

[0002]假尿嘧啶核苷简称假尿苷(pseudouridine，ψ)。与尿苷相比，假尿苷的碱基与核糖之间不是通过N
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C键而是C
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C键相连。是核糖与尿嘧啶(uracil，U)通过C1
’‑
C5相连后成为尿苷的异构体。是生物体内广泛存在的一种RNA修饰方式，因此它也被称为“第五个碱基”。假尿苷的结构式如图1。
[0003]研究发现，假尿苷广泛存在与tRNA,rRNA，mRNA，snRNA和snoRNA中，增强RNA的稳定性和提高蛋白质的翻译效率。假尿苷具有仅从肾脏排泄的特点，可用于监测肿瘤的发生、发展及肾病的诊治。随着对假尿苷研究的深入，研究者还发现痛风、银屑病患者尿液假尿苷水平明显升高。因此，假尿苷可作为一个潜在的生物标志物，用于肾病与肿瘤等多种疾病的诊断、疗效监测。近年来核酸药物开发中发现，假尿苷替代尿苷后，能提高抗原表达水平以及增强免疫反应。因此，假尿苷的潜在需求越来越大，其生产方法也引起广泛关注。
[0004]目前假尿苷有以下几种生产方法。一种是化学合成法。化学合成法反应步骤多，收率低，同时还面临生产安全、环保压力。2021年美国科学家提出了半酶法合成方法，但是总体收率仍然有待提高，而且生产起始原料相对比较昂贵。专利CN112592880B利用大肠杆菌发酵生产假尿苷，但是产量还不够高。专利CN112592880B公布了一项链霉菌发酵的方法生产假尿苷，但是产量低，而且链霉菌生长缓慢，还不能实现商业化生产。
[0005]针对假尿苷生产存在的问题，本专利技术通过构建高产假尿苷的大肠杆菌基因工程菌，实现假尿苷绿色经济的生产方法。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种产假尿苷工程菌：
[0007]一种产假尿苷工程菌，利用基因工程技术在宿主菌中敲除嘧啶生物合成途径相关的基因且过量表达假尿嘧啶核苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌。
[0008]优选的，敲除的所述嘧啶生物合成途径相关的基因为：pepA、thrA和argF基因；所述pepA基因序列是SEQ ID No1，thrA基因序列是SEQ ID No8，argF的基因序列是SEQ ID No15。
[0009]优选的，过量表达的所述假尿嘧啶核苷合成相关的基因是UDP、psuG、磷酸酶基因，所述UDP基因的蛋白序列为SEQ ID No55；所述psuG基因的蛋白序列为SEQ ID No56、SEQ ID No57、SEQ ID No58或者SEQ ID No59；所述磷酸酶基因的蛋白序列为SEQ ID No54、SEQ ID No60、SEQ ID No61、SEQ ID No62或者SEQ ID No63。
[0010]优选的，利用基因工程技术在宿主菌中敲除了假尿嘧啶核苷激酶基因psuK，基因序列是SEQ ID No22。
[0011]优选的，利用基因工程技术在宿主菌中敲除了基因psuT，基因序列是SEQ ID No29。
[0012]一种产假尿嘧啶核苷的基因工程菌在产假尿苷中的应用。
[0013]一种生产假尿苷的方法，挑取上述一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接种于装有LB培养液的试管，其中加入终浓度为50μg/ml的硫酸卡那霉素，30℃，220rpm培养过夜，然后按1％的接种量接种到装有20ml发酵液的摇瓶，37℃，220rpm培养四个小时后，加入IPTG终浓度至50μg/ml,然后摇瓶放置30℃，220rpm发酵培养，从而生产假尿苷。
[0014]优选的，所述LB培养液的组成是：酵母抽屉粉0.5％，胰蛋白胨1.0％，氯化钠1.0％。发酵培养基组成是：胰蛋白胨1.0％,酵母抽提0.5％,甘油2.0％，硫酸锰0.1mM，KH2PO
4 0.231％，K2HPO41.254％，pH 7.0。
[0015]另一种生产假尿苷的方法，挑取上述一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接入种子培养基中，36℃，250rpm培养15h得到种子液，再按照10％的接种量，吸取1单位体积的种子液至发酵培养基中，接种后培养基总体积为10单位体积，所述发酵培养的培养基配方(g/L)如下：葡萄糖15，KH2PO44，酵母粉6；硫酸铵8，MgSO4·
7H2O 4；培养基中其他组分(mg/L)：FeSO4·
7H2O 150，MnSO4·
7H2O 20，氯化钴3.5，硫酸锌3.5，氯化钙8，另外培养基中加入卡纳霉素50mg/L。
[0016]优选的，发酵过程中，培养基pH用含氨13mol/L的氨水调控在7.0，发酵温度在0
‑
3h保持在37℃，发酵第3h加入IPTG终浓度至50μg/ml，同时发酵温度调整到30℃，流加葡萄糖保持终浓度0.1％左右，发酵过程中通气设定为1.0vvm，通过搅拌转速和溶氧联动，控制溶氧在30％
‑
40％，发酵周期72h。
[0017]原理说明：
[0018]1、改造嘧啶生物合成途径
[0019]天冬氨酸和Carbamoyl
‑
P是生物合成嘧啶的前体，同时它们分别由thrA和argF合成4
‑
磷酸天冬氨酸和瓜氨酸。因此敲除thrA和argF能提高合成嘧啶的代谢流，提高合成假尿苷的前体尿嘧啶的产量。在嘧啶生物合成过程中，基因carAB受到pepA的负调控，受嘧啶反馈抑制。因此对pepA进行敲除能解除嘧啶的反馈抑制。对嘧啶生物合成的最后一步的udp基因过量表达，提高尿嘧啶合成效率，减少尿苷的积累。
[0020]2、以尿嘧啶和5
‑
磷酸核糖为底物催化合成假尿苷(Ψ)
[0021]在原核生物中普遍存在ΨMP糖苷酶基因(psuG)，能够以催化尿嘧啶和5
‑
磷酸核糖合成ΨMP。一部分真核生物中也存在ΨMP糖苷酶活性的基因，但是一种双功能基因，其往往还具有ΨMP激酶活性。在大肠杆菌中过量表达psuG和磷酸化酶基因，能最终产生假尿苷。
[0022]3、阻断假尿苷的代谢降解途径
[0023]psuG具有双向催化活性，它不但能催化合成假尿苷单磷酸，同时还能催化假尿苷单磷酸分解为5
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磷酸核糖和尿嘧啶。而psuK具有假尿苷激酶活性，能使假尿苷磷酸化，然后在psuG的催化下降解。因此敲除psuK由利于减少假尿苷的降解。
[0024]4、阻断假尿苷转运到胞内
[0025]psuT具有假尿苷转运功能，能吸收胞外的假尿苷。敲除psuT由利于假尿苷在胞外累。
[0026]有益效果：相较于现有的假尿苷生产方法，首先，现有的菌种发酵方法产量为7g/
L，而本方案产量可以高达11.6g/L，显著提高了产量，降低了成本；其次，其他原有的生产方法一般以采用化学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产假尿苷工程菌，其特征在于：利用基因工程技术在宿主菌中敲除嘧啶生物合成途径相关的基因且过量表达假尿嘧啶核苷合成相关的基因，得到可产假尿苷的基因工程菌。2.根据权利要求1所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：敲除的所述嘧啶生物合成途径相关的基因为：pepA、thrA和argF基因；所述pepA基因序列是SEQ ID No1，thrA基因序列是SEQ ID No8，argF的基因序列是SEQ ID No15。3.根据权利要求2所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：过量表达的所述假尿嘧啶核苷合成相关的基因是UDP、psuG、磷酸酶基因，所述UDP基因的蛋白序列为SEQ ID No55；所述psuG基因的蛋白序列为SEQ ID No56、SEQ ID No57、SEQ ID No58或者SEQ ID No59；所述磷酸酶基因的蛋白序列为SEQ ID No54、SEQ ID No60、SEQ ID No61、SEQ ID No62或者SEQ ID No63。4.根据权利要求1所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：利用基因工程技术在宿主菌中敲除了假尿嘧啶核苷激酶基因psuK，基因序列是SEQ ID No22。5.根据权利要求1所述的一种产假尿苷工程菌，其特征在于：利用基因工程技术在宿主菌中敲除了基因psuT，基因序列是SEQ ID No29。6.根据权利要求1所述的一种如权利要求1
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5所述任一种产假尿嘧啶核苷的基因工程菌在产假尿苷中的应用。7.一种生产假尿苷的方法，挑取权利要求1
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5任一种假尿嘧啶核苷的基因工程菌的单菌落接种于装有LB培养液的试管，其中加入终浓度为50μg/ml的硫酸卡那霉素，30℃，220rpm培养过夜...

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏，唐正菊，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：