本发明专利技术公开了一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法。肠道隐窝分离液包括氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸，可快速分离炎症性肠病肠道隐窝，并可体外培养形成隐窝类器官模型。本发明专利技术不论是肠道隐窝的分离方法还是分离后隐窝的体外培养过程，均表现出方法简易，构建迅速，可操作性强的良好特征，适用于炎症性肠病发生发展的基础研究、潜在有效治疗药物的筛选等，具有产业化意义。具有产业化意义。具有产业化意义。
【技术实现步骤摘要】
一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法。
技术介绍
[0002]临床统计表明，炎症性肠病可发生于任何年龄的人群，但通常在15到40岁之间被诊断出来。炎症性肠病一词主要用于描述两种情况：溃疡性结肠炎和克罗恩病。溃疡性结肠炎和克罗恩病均为涉及肠道炎症的长期、慢性疾病。其中，溃疡性结肠炎只影响结肠（大肠），而克罗恩病可以影响消化系统的任何部分，即从口腔到肛门。目前尚不清楚导致炎症性肠病的根本原因，但多方的研究认为，炎症性肠病是由多种因素共同造成，包括：遗传学上的患者近亲结婚、免疫系统紊乱以及吸烟等。目前还没有治愈溃疡性结肠炎或克罗恩病的方法，其治疗过程旨在缓解症状并防止其复发，该过程包括特定的饮食、生活方式的改变、药物和手术等。此外，临床上，炎症性肠病的症状可以反反复复，表现为有时症状可能很严重（突然发作），然后是长时间几乎没有或根本没有症状（缓解），给患者的生活带来了极大的困扰。因此，揭开炎症性肠病发生的分子机制及采用有效治疗策略非常重要。目前来说，炎症性肠病的研究模型主要是使用DSS或TNBS诱导小鼠发病。该动物模型虽然在炎症性肠病发生发展的机制和治疗药物筛选上具有一定的参考意义，但是该模型主要为药物诱导模型，致病因素较为明确单一，不符合实际患者的复杂因素致病情况，且研究内容较为宏观。因此，一种更加符合临床真实致病情况，且可以做细胞分子层面深入研究的体外模型亟待开发。
[0003]类器官是一种利用细胞干性构建的、具有多种特异细胞类型的体外研究模型，其可以来源于胚胎细胞、成人干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞等。到目前为止，多种人类上皮组织，包括结肠、胰腺、前列腺和乳腺等，均被报道可以形成体外类器官。隐窝作为重要的肠道组织结构单位，不仅含有肠道再生、修复的各种干细胞亚群，而且具有形成体外类器官的能力。关于利用炎症性肠病患者肠组织分离隐窝做3D类器官培养的方法鲜有报道。近些年的研究表明，类器官不但能够很好地保留来源组织的表型和遗传特性，而且还具有复杂的内部结构，在功能及构造上趋近于相应体内结构。因此，基于多细胞组分的隐窝类器官体外疾病模型可以很好地重现炎症性肠病患者肠组织中细胞微环境，保留细胞间的互相作用，为深入研究炎症性肠病发生发展的机制、潜在治疗药物的体外筛选提供了新途径。
技术实现思路
[0004]本专利技术针对目前炎症性肠病的研究模型主要为药物诱导模型，致病因素较为明确单一，不符合实际患者的复杂因素致病情况的问题，提供一种炎症性肠病肠道隐窝分离液、分离方法及体外3D类器官培养方法，进而获得一种更加符合临床真实致病情况，且可以做细胞分子层面深入研究的体外3D类器官模型。
[0005]本专利技术首先提供一种炎症性肠病肠道隐窝分离液，包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
[0006]优选的炎症性肠病肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
[0007]本专利技术另外提供一种炎症性肠病肠道隐窝分离方法，包括以下步骤：步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
[0008]优选的炎症性肠病肠道隐窝分离方法步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5
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10mm3，肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸。
[0009]本专利技术还提供一种炎症性肠病肠道隐窝体外3D类器官培养方法，包括以下步骤：步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；步骤三：用基质胶包被分离的肠道隐窝，并等待基质胶凝固；步骤四：加入肠道隐窝类器官培养基，静置培养；步骤五：使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；步骤六：收集培养好的隐窝类器官。
[0010]所述步骤二肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2 mmol/L 氯化钾、90~100mmol/L 氯化钠、6~10 mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L 磷酸二氢钠、2~3 mmol/L 乙二胺四乙酸、400~600 mmol/L 乙二醇双四乙酸；所述肠道隐窝类器官培养基包括以下浓度的组分：100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、5~15 mmol/L 4
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羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、2~6 mmol/L L
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谷氨酰胺（GlutaMAX）、40 ~60mmol/L 表皮生长因子（EGF）、100 mmol/L wnt通路配体蛋白3、10 mmol/L ROCK 抑制剂、500 nmol/L TGF
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βI型受体抑制剂(A83
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01)、10 mmol/L p38
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MAPK 抑制剂、1% (vol/vol) N2细胞培养添加剂、1% (vol/vol) B27细胞培养添加剂、10% (vol/vol) 胎牛血清（FBS）、4% (vol/vol)Rspo
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1 条件培养基 和 4% (vol/vol) Noggin
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Fc 融合蛋白条件培养基和高级DMEM/F12培养基。
[0011]所述步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5
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10mm3，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5 mmol/L 氯化钾、96 mmol/L 氯化钠、8 mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L 磷酸二氢钠、2.5 mmol/L 乙二胺四乙酸、500 mmol/L 乙二醇双四乙酸；所述步骤五每隔1
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3天使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；所述步骤六第8~12天收集培养好的隐窝类器官。
[0012]所述步骤五每隔2天使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；
所述步骤六第10天收集培养好的隐窝类器官。
[0013]所述步骤三将分离的肠道隐窝使用PBS调整密度为50个隐窝/10ul后，按本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种炎症性肠病肠道隐窝分离液，其特征在于，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2mmol/L氯化钾、90~100mmol/L氯化钠、6~10mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L磷酸二氢钠、2~3mmol/L乙二胺四乙酸、400~600mmol/L乙二醇双四乙酸。2.根据权利要求1所述的炎症性肠病肠道隐窝分离液，其特征在于，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5mmol/L氯化钾、96mmol/L氯化钠、8mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L磷酸二氢钠、2.5mmol/L乙二胺四乙酸、500mmol/L乙二醇双四乙酸。3.一种炎症性肠病肠道隐窝分离方法，其特征在于所述分离方法包括以下步骤：步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2mmol/L氯化钾、90~100mmol/L氯化钠、6~10mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L磷酸二氢钠、2~3mmol/L乙二胺四乙酸、400~600mmol/L乙二醇双四乙酸。4.根据权利要求3所述的炎症性肠病肠道隐窝分离方法，其特征在于，所述步骤二中将大块炎症性肠病肠道组织切成5
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10mm3，所述肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1.5mmol/L氯化钾、96mmol/L氯化钠、8mmol/L磷酸氢二钾、10mmol/L磷酸二氢钠、2.5mmol/L乙二胺四乙酸、500mmol/L乙二醇双四乙酸。5.一种炎症性肠病肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述体外3D类器官培养方法包括以下步骤：步骤一：将炎症性肠病肠道组织清理杂质和黏液；步骤二：将大块炎症性肠病肠道组织切块，使用配制的隐窝分离液分离肠道隐窝；步骤三：用基质胶包被分离的肠道隐窝，并等待基质胶凝固；步骤四：加入肠道隐窝类器官培养基，静置培养；步骤五：使用肠道隐窝类器官培养基半量换液，维持培养；步骤六：收集培养好的隐窝类器官。6.根据权利要求5所述的肠道隐窝体外3D类器官培养方法，其特征在于，所述步骤二肠道隐窝分离液包括以下浓度的组分：1~2mmol/L氯化钾、90~100mmol/L氯化钠、6~10mmol/L磷酸氢二钾、5~15mmol/L磷酸二氢钠、2~3mmol/L乙二胺四乙酸、400~600mmol/L乙二醇双四乙酸；所述肠道隐窝类器官培养基包括以下浓度的组分：10...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘海洋，何萌萌，宫晓艳，黄璘，
申请(专利权)人：北京嘉士腾医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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