【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基及方法。
技术介绍
1、类器官(organoid)是一种体外3d培养的能够形成立体组织结构的生物模型，可以作为多种疾病诊疗的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、肿瘤精准医疗、病因病理、药物开发等多个方面拥有广泛的应用前景。类器官作为一种新的“模式生物”,由于其组成、结构和功能与体内器官非常接近,可为探究人体发育、疾病发生机制及筛选高通量药物等提供一个全新的工具。
2、肝脏是人体重要的代谢调控中心,参与糖类、脂肪以及氨基酸的合成和分解；作为解毒中心,其能够降解多种药物和乙醇等分子；肝脏通过合成并分泌胆盐和胆汁酸等执行外分泌功能。但肝脏可同时受到多种原因包括病毒感染、过量饮酒、炎症、代谢性因素、遗传变异和自身免疫改变,以及恶性肿瘤等的损害。肝脏疾病的发病率及致死率正逐年上升,全世界每年约有200万人死于肝衰竭。迄今为止,研究肝脏疾病主要依赖于细胞系和动物模型。由于传统二维(two dimensional,2d)细胞培养体系的局限性,体外培养的肝实质细胞通常缺乏某些肝脏特异性的基因及特定的生物功能,如细胞色素p450的维持、细胞间特定的连接等,尤其是缺乏不同类型细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用,因此,不能很好地重现肝脏细胞的异质性及复杂的结构特征。用于肝脏疾病研究的动物模型优于2d培养的细胞,其优点包括具有功能性的脉管系统、基质和免疫成分,但动物模型的局限性在于其不同的生理、药物代谢特征以及对遗传基因变异所致疾病的不同表型。目前主要应用的小动物如小鼠和大鼠肝
技术实现思路
1、本专利技术针对目前肝脏类动物模型主要是小动物如小鼠和大鼠肝脏类器官，且形成率低，生长速率慢，应用也有局限性，提供一种高效构建大型动物如兔源肝脏类器官的方法。
2、本专利技术首先提供一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基，包括以下组分：wnt3a条件培养基、r-spondin1条件培养基、noggin、hepes、1×glutamax、penicillin/streptomycin、n2细胞培养添加剂、b27细胞培养添加剂、mem非必需氨基酸溶液(neaa)、nicotinamide、n-acetylcystein、a8301、human egf、human hgf、human fgf10、gastrin 1、forskolin、含有y27632的advance dmem/f12。
3、本专利技术优选的培养基包括以下组分：40-60％(v/v)wnt3a条件培养基、9-11％(v/v)r-spondin1条件培养基、10-30ng/ml noggin、4-6mmol/ml hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1-2％(v/v)n2细胞培养添加剂、1-2％(v/v)b27细胞培养添加剂、1-2％(v/v)mem非必需氨基酸溶液(neaa)、1-3mmol/ml nicotinamide、1-2mmol/ml n-acetylcystein、4-6umol/mla8301、40-60ng/ml human egf、40-60ng/ml human hgf、40-60ng/ml human fgf10、9-11nmol/ml gastrin 1、9-11umol/ml forskolin、含有9-11umol/ml y27632的advance dmem/f12。
4、本专利技术进一步优选的培养基包括以下组分：50％(v/v)wnt3a条件培养基、10％(v/v)r-spondin1条件培养基、20ng/ml noggin、5mmol/ml hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1％(v/v)n2细胞培养添加剂、1％(v/v)b27细胞培养添加剂、1％(v/v)mem非必需氨基酸溶液(neaa)、2mmol/ml nicotinamide、1mmol/ml n-acetylcystein、5umol/mla8301、50ng/ml human egf、50ng/ml human hgf、50ng/ml humanfgf10、10nmol/ml gastrin1、10umol/ml forskolin、含有10umol/ml y27632的advancedmem/f12。
5、本专利技术另外提供一种高效构建兔源肝脏类器官的方法，包括以下步骤：
6、步骤一：兔源肝脏组织的消化分离：
7、步骤二：兔源肝脏组织类器官的接种培养；
8、步骤三：兔源肝脏组织类器官传代培养；
9、所述步骤二兔源肝脏组织类器官的接种培养包括以下步骤：
10、1)细胞接种：将分离好的原代细胞中加入advanced dmem/f12(含1％v/v青霉素-链霉素和庆大霉素)培养液，混匀，离心；弃上清，将收集到的细胞/组织沉淀用权利要求1-3任一所述的兔源肝脏类器官的培养基重悬后，加入预制的基质胶顶部，使其自然分散得细胞团；
11、2)类器官培养-on-top法：将上述细胞团接种在预制的基质胶中置于37℃、二氧化碳含量5％的环境中进行培养3-5天，过程中每2-3天进行一次换液，加入培养基时，吸头朝向侧壁，避免破坏基质胶；
12、3)类器官的培养-包埋法：将上述培养的类器官转至胶滴中进行包埋培养，吸去培养上清，每孔加入3ml dispase ii(分散酶ii)，用巴斯德滴管将胶滴吹散，于37℃条件下孵育15-20分钟，收集悬液，使用1ml吸头吹打10-20次；4℃、250g条件下离心5分钟，去上清，向细胞沉淀中加入稀释的基质胶混匀，兔源类器官培养基与基质胶的体积比为1:2；按照每滴25-40μl的体积接种至细胞培养板中，将培养板放置于37℃co2培养箱，加热30min，待胶体凝固后，将培养板取出，加入预热的类器官培养液600μl/孔，周边孔加入适量的无菌pbs或双蒸水，减少培养液蒸发，3-4天更换培养液，加入培养液时，吸头朝向侧壁，避免破坏基质胶。
13、步骤一兔源肝脏组织的消化分离包括以下步骤：
14、1)组织的清洗：取新鲜的兔源组织，放入离心管中加入10倍体积的pbs摇晃清洗，并弃去上清；
15、2)组织切碎：将清洗后的组织转移到10cm培养皿中，用手术刀切碎至0.5mm3的小块；
16、3)组织消化：将组织碎片置于离心管中，加入至少5倍体积的组织消化液，在恒温摇床中，37℃，200rpm消化处理；边消化边观察，使用短时多次的方法进行消化，具体指每次消化时间控制在3-5分钟，重复上述步骤，直至组织大部分消化，仅剩少量的组织碎片；
17、4)细胞收集：通过自然沉降收集上悬液并加入大比例pbs置冰上终止，4℃，300g，离心5分钟，离心去除上清，收集消化后的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基，其特征在于，包括以下组分：Wnt3a条件培养基、R-spondin1条件培养基、Noggin、HEPES、1×GlutaMax、penicillin/streptomycin、N2细胞培养添加剂、B27细胞培养添加剂、MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)、nicotinamide、N-acetylcystein、A8301、human EGF、human HGF、human FGF10、Gastrin 1、Forskolin、含有Y27632的advance DMEM/F12。
2.根据权利要求1所述的一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基，其特征在于，包括以下组分：40-60％(V/V)Wnt3a条件培养基、9-11％(V/V)R-spondin1条件培养基、10-30ng/mLNoggin、4-6mmol/mL HEPES、1×GlutaMax、1×penicillin/streptomycin、1-2％(V/V)N2细胞培养添加剂、1-2％(V/V)B27细胞培养添加剂、1-2％(V/V)MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)、1-
3.根据权利要求1所述的一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基，其特征在于，包括以下组分：50％(V/V)Wnt3a条件培养基、10％(V/V)R-spondin1条件培养基、20ng/mL Noggin、5mmol/mL HEPES、1×GlutaMax、1×penicillin/streptomycin、1％(V/V)N2细胞培养添加剂、1％(V/V)B27细胞培养添加剂、1％(V/V)MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)、2mmol/mLnicotinamide、1mmol/mL N-acetylcystein、5umol/mlA8301、50ng/mL human EGF、50ng/mLhuman HGF、50ng/mL human FGF10、10nmol/mL Gastrin 1、10umol/mL Forskolin、含有10umol/ml Y27632的advance DMEM/F12。
4.一种高效构建兔源肝脏类器官的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种高效构建兔源肝脏类器官的方法，其特征在于，步骤一兔源肝脏组织的消化分离包括以下步骤：
6.根据权利要求4所述的一种高效构建兔源肝脏类器官的方法，其特征在于，所述步骤三兔源肝脏组织类器官传代培养包括以下步骤：
7.根据权利要求4所述的一种高效构建兔源肝脏类器官的方法，其特征在于，细胞接种步骤中所述预制的基质胶是将基质胶与advance DMEM/F12按体积比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一层1mm的凝胶层。
...【技术特征摘要】
1.一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基，其特征在于，包括以下组分：wnt3a条件培养基、r-spondin1条件培养基、noggin、hepes、1×glutamax、penicillin/streptomycin、n2细胞培养添加剂、b27细胞培养添加剂、mem非必需氨基酸溶液(neaa)、nicotinamide、n-acetylcystein、a8301、human egf、human hgf、human fgf10、gastrin 1、forskolin、含有y27632的advance dmem/f12。
2.根据权利要求1所述的一种高效构建兔源肝脏类器官的培养基，其特征在于，包括以下组分：40-60％(v/v)wnt3a条件培养基、9-11％(v/v)r-spondin1条件培养基、10-30ng/mlnoggin、4-6mmol/ml hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1-2％(v/v)n2细胞培养添加剂、1-2％(v/v)b27细胞培养添加剂、1-2％(v/v)mem非必需氨基酸溶液(neaa)、1-3mmol/ml nicotinamide、1-2mmol/ml n-acetylcystein、4-6umol/mla8301、40-60ng/mlhuman egf、40-60ng/ml human hgf、40-60ng/ml human fgf10、9-11nmol/ml gastrin 1、9-11umol/ml forskolin、含有9-11umol/ml y27632的advance dmem/f...
【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓艳，阚方明，马晓瑞，王志强，史忠玺，黄璘，
申请(专利权)人：北京嘉士腾医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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