一种紫点海葵多肽毒素HC-G02及其合成方法、应用技术

本发明专利技术提供一种紫点海葵多肽毒素HC

【技术实现步骤摘要】
一种紫点海葵多肽毒素HC
‑
G02及其合成方法、应用


[0001]本专利技术属于活性多肽
，涉及一种紫点海葵多肽毒素HC
‑
G02及其合成方法、应用。

技术介绍

[0002]海葵为刺胞门、珊瑚虫纲、海葵目生物，是在世界范围内的深海和浅海水域都能够发现的一种海洋动物。海葵是现存最古老的有毒动物目之一，分子和化石数据表明它们的起源早于7.5亿年前的埃迪卡拉纪。海葵种类繁多，在全球已记录海葵目1100余种，分属于50科约400个属，而中国海葵物种约占世界的1/10。中国海葵物种多样性在南海分布最高。海葵触手上具有刺细胞，与其他刺胞动物一样，海葵将毒液集中在被称为刺丝囊的囊状细胞器中。与猎物接触时刺丝囊会穿透目标生物体，释放毒液麻痹或杀死对方以进行捕食、防御和威慑竞争对手。
[0003]《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩等功效，民间主要用来治疗痔疮、脱肛、绕虫病和体癣等。现代药理学研究表明海葵毒素具有镇痛等作用。

技术实现思路

[0004]本专利技术从紫点海葵中筛选出活性多肽序列，并通过氧化折叠合成紫点海葵功能多肽。通过镇痛实验阐明该海葵多肽具有一定镇痛活性。本专利技术为开发新型海洋药物奠定基础，为人类健康和海洋药物研究提供有力支撑。
[0005]本专利技术方案为：
[0006]一种紫点海葵多肽毒素HC
‑
G02，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC
‑
NH2，其具有四个半胱氨酸形成两个二硫键，二硫键的连接方式为C1
‑
C3，C2
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C4。
[0007]本专利技术还提供了所述紫点海葵多肽毒素HC
‑
G02的合成方法，包括以下步骤：
[0008](1)称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入Fmoc
‑
Ala
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OH、二氯甲烷和N,N
‑
二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；
[0009](2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc
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Pro
‑
OH和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N
‑
二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；
[0010](3)根据前述的HC
‑
G02的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
[0011](4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
[0012](5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC
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G02；
[0013](6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇水溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；
[0014](7)再加入等体积盐酸
‑
甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；
[0015](8)纯化后得到多肽纯品。
[0016]进一步的，步骤(1)为：称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入0.6～1.0mmol Fmoc
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Ala
‑
OH、10～15mL二氯甲烷和1～3mL N,N
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二异丙基乙胺进行反应80～100min，后再加3～5mL甲醇和8～12mL二氯甲烷封闭反应25～35min，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为20％的DMF溶液。
[0017]进一步的，步骤(2)为：在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol第二个氨基酸Fmoc
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Pro
‑
OH和1.5～2.0mmol缩合剂，再加入5～15mL二甲基甲酰胺和1～3mL N,N
‑
二异丙基碳二亚胺反应0.5～1.5h，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为20％的DMF溶液。
[0018]进一步的，所述切割液含有：95wt％三氟乙酸、1wt％H2O、2wt％1,2
‑
乙二硫醇和2wt％三异丙基硅烷。
[0019]进一步的，步骤(6)为：将步骤(5)的线性肽溶于50v/v％甲醇水溶液中，再用乙酸稀释使肽液最终浓度为每毫升含有肽1mg，滴加10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键。
[0020]进一步的，步骤(7)为：再加入等体积盐酸
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甲醇溶液，然后加入10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；
[0021]进一步的，步骤(8)中，利用高效液相色谱法进行纯化，纯化条件为：流动相A为H2O，流动相B为乙腈，流速5mL/min，45min线性梯度洗脱，流动相B体积占比由5％线性升至50％。
[0022]本专利技术还提出所述的紫点海葵多肽毒素HC
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G02在制备镇痛剂方面的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0024]1、本专利技术利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现紫点海葵多肽毒素HC
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G02，其氨基酸序列APCSGCYYQVGNECVYDKLKC
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NH2，具有四个半胱氨酸可以形成两个二硫键。
[0025]2、本专利技术通过多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽HC
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G02，对线性肽进行HPLC纯化，然后利用分步法对合成的线性肽进行氧化折叠，通过二硫键定点氧化后获得含有两个二硫键的氧化肽HC
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G02，二硫键的连接方式为C1
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C3，C2
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C4。
[0026]3、本专利技术提供紫点海葵(Heteractis crispa)多肽毒素HC
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G02的合成方法及其镇痛作用，该方法合成的紫点海葵多肽毒素HC
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G02具有高效镇痛效果，可为研发新型、高效、安全生物镇痛剂奠定基础。
[0027]4、本专利技术通过热板实验发现紫点海葵氧化肽HC
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G02对小鼠物理性疼痛具有良好的镇痛作用，小鼠腹腔注射氧化肽HC
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G02后，在30min痛阈提高率逐渐升高，给药后120min痛阈提高率达到最高。氧化肽HC
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G02在50mg/kg下的镇痛效果与同等浓度的曲马多的镇痛效果相当，且镇痛时间延长。
附图说明
[0028]图1为HPLC分析线性肽HC
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫点海葵多肽毒素HC
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G02，其特征在于，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC
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NH2。2.根据权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC
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G02，其特征在于，所述紫点海葵多肽毒素HC
‑
G02具有四个半胱氨酸形成两个二硫键，二硫键的连接方式为C1
‑
C3和C2
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C4。3.权利要求1所述紫点海葵多肽毒素HC
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G02的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入Fmoc
‑
Ala
‑
OH、二氯甲烷和N,N
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二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc
‑
Pro
‑
OH和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N
‑
二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；(3)根据权利要求1所述的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；(5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC
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G02；(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇水溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；(7)再加入等体积盐酸
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甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；(8)纯化后得到多肽纯品。4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)为：称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入0.6～1.0mmol Fmoc

【专利技术属性】
技术研发人员：高炳淼，郭琦琦，李明，林成章，华子强，卓妍，廖燕玲，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：