一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL

【技术实现步骤摘要】
一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素蛋白PFL
‑
96及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体而言，涉及一种重组蛋白药物，尤其涉及一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL
‑
96及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]合浦珠母贝(Pinctadafucata martensii)，又称马氏珠母贝，主要分布在我国广西、广东、海南、福建、台湾等沿海省份，是我国重要的海水养殖贝类和生产海水珍珠的主要贝种之一，所产珍珠被称为“南海珍珠”，晶莹剔透，圆润光泽，素有“东珠不如西珠，西珠不如南珠”美誉。近年来随着沿海经济高速发展，生态环境遭到严峻破坏，沿海水质日趋恶化，导致合浦珠母贝病害严重，尤其是细菌病害中的弧菌感染，严重制约到合浦珠母贝养殖业的发展，对我国南珠产业及其多元化发展造成重要影响。另一方面，在水产养殖业中抗生素的滥用所带来的环境污染、耐药菌株出现及人类健康等问题是全球性的。当下“减抗、替抗、限抗、禁抗”绿色养殖理念已深入人心，因此开发具有抗合浦珠母贝病害，提升珍珠养殖质量的抗生素替代品已成为研究热点。
[0003]合浦珠母贝属于海洋无脊椎动物，具有其独特的复杂天然免疫系统，其中凝集素是其天然免疫系统中重要的模式识别分子之一。合浦珠母贝在低温、高盐、高压的复杂海洋环境中产生了多种糖特异性结合的凝集素，具有调节机体代谢及通过识别和结合入侵病原体表面的糖残基参与宿主防御等诸多生理功能。目前在合浦珠母贝中已鉴定出五种凝集素或凝集素样基因，包括C
‑r/>型凝集素、F
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型凝集素、半乳糖结合凝集素、α
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N
‑
乙酰半乳糖结合凝集素和血清凝集素亚型
‑
2，在宿主防御中发挥作用。然而，关于凝集素在合浦珠母贝免疫系统中的作用还未见深入报道。研究合浦珠母贝的凝集素不仅对深入了解合浦珠母贝对病原微生物免疫防控的机制，及开发制备新型替代抗生素的天然活性肽类药物用于合浦珠母贝健康养殖，以及用于人类疾病治疗方面具有重要意义。

技术实现思路

[0004]鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL
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96蛋白及其编码基因和应用。
[0005]为了实现上述技术目的，本专利技术人通过深度测序筛选合浦珠母珍珠层和棱柱层形成的新基因，得到一种编码具有假定半乳糖结合凝集素结构域的蛋白质(命名为PFL
‑
96)，该蛋白在珍珠层形成中发挥重要作用，并且其作为一种凝集素蛋白具有抵御病原体的生物活性。
[0006]基于上述研究成果，实现本专利技术技术目的的技术方案如下：一种合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
‑
96，所述PFL
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96的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
‑
96的制备方法包括：(1)克隆获得去掉假定信号肽的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素基因片段，将其连入原核表达载体
pET
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28a，获得原核表达重组质粒pET
‑
28a
‑
PFL
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96；(2)氯化钙热激法导入大肠杆菌BL21，获得重组菌株；(3)培养上述重组菌株，诱导重组蛋白PFL
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96表达；(4)包涵体变性、复性、纯化及透析获得合浦珠母贝定半乳糖结合凝集素蛋白PFL
‑
96。
[0008]进一步地，本专利技术还提供了上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96的编码基因，该基因编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。具体地，上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96的基因编码序列如SEQ ID NO:2所示；适用于原核表达经密码子优化后的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]进一步地，本专利技术还提供一种重组载体、重组细胞。该重组载体携带上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96的编码基因。所述重组载体为将上述编码基因插入出发载体pET
‑
28a的多克隆位点得到的重组载体。也可用现有的其它表达载体构建含有所述基因的重组载体。该重组细胞所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，即将上述编码基因插入出发载体pET
‑
28a的多克隆位点得到的重组表达载体后转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到所述重组细胞。
[0010]另外，本专利技术还提供了一种上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96在制备抑制或/和杀灭细菌的药物、保健品或食品添加剂中的应用，所述的细菌选自如下的至少一种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、溶藻弧菌。
[0011]另外，本专利技术还提供了一种上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96在制备抗癌药物中的应用。所述的癌症为鼻咽癌、肝癌或宫颈癌。
[0012]与现有技术相比，本专利技术提供的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL
‑
96蛋白，能抑制和杀灭金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、溶藻弧菌，同时能显著抑制人鼻咽癌细胞C666
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1、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela的增殖，可以开发成替代抗生素的天然活性肽类药物用于合浦珠母贝健康养殖，也可以制备成人用的抗菌抗癌药物，为人类疾病治疗提供新型的原料。
附图说明
[0013]图1A为从合浦珠母贝肉cDNA中克隆获得的去掉信号肽的半乳糖结合凝集素PFL
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96基因片段；图1B为构建到原核表达载体pET
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28a上的阳性克隆子菌落PCR验证结果。
[0014]图2A为原核生物表达目的蛋白SDS
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PAGE凝胶电泳鉴定结果；M为蛋白质分子质量标准；1为pET
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28a空载体诱导；2为pET
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28a空载体未诱导；3为重组质粒诱导后；4为重组质粒诱导破碎后上清；5为重组质粒诱导破碎后沉淀。图2B为蛋白质纯化SDS
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PAGE鉴定结果；M为蛋白质分子质量标准；1为破碎后处理样品；2为纯化过程流穿样品；3和4为纯化过程洗脱样品。图2C为纯化后蛋白SDS
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PAGE鉴定结果；M为蛋白质分子质量标准；1为0.5mg/mL牛血清蛋白(BSA)；2为纯化后目的蛋白样品。
[0015]图3为采用牛津杯法测定凝集素PFL
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96对各菌株的抑菌活性结果。
[0016]图4为采用96孔法测定凝集素PFL
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96对各菌株的最小抑菌浓度结果。
[0017]图5为采用涂板法确定凝集素PFL
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96对各菌株的最小杀菌浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96，其特征在于，所述PFL
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96的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96的编码基因，其特征在于，该基因编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。3.根据权利要求2所述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL
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96的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。4.一种携带权利要求2或3所述编码基因的载体、重组细胞。5.根据权利要求4所述的载...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏，林江，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：