重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用，涉及蛋白质领域，其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[C

【技术实现步骤摘要】
重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质领域，尤其涉及重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维、生物蛋白纤维的制备方法，及它们的应用。

技术介绍

[0002]蜘蛛丝是已知最坚韧的天然蛋白纤维，具有良好的机械性能和生物学品质，拉伸强度高达1.0
‑
1.7GPa，延展性可达58％
‑
69％，韧性可达180MJ/m3，与传统高分子纤维相比，它所具有的“高强
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高韧”力学特性使其具有不可比拟的优势。同时，蛛丝纤维具有低密度、耐低温、生物相容性好及可降解等特点，因此在生物医学工程、高端运动器械以及特种装备等领域具有广阔的应用前景。
[0003]十字园蛛(Araneus diadematus)大壶腹腺分泌的牵引丝因机械性能优异得到普遍研究。它被称为蜘蛛的生命线，当蜘蛛突然坠落地面时牵引丝的强度足以承受蜘蛛自身重量，从而避免受到伤害。然而，由于天然蛛丝的产量较低且蜘蛛无法像家蚕一样进行群体饲养，人造蛛丝纤维制备主要通过表达重组蛛丝蛋白并进行人工纺丝来实现。十字园蛛大壶腹腺牵引丝特有的两种蛛丝蛋白ADF3和ADF4与力学性能密切相关。目前已有多个研究报道了通过细菌表达系统制备重组ADF3或ADF4蛋白并利用重组蛋白进行纤维制备。
[0004]但是，重组蛋白纤维的力学性能与天然蛛丝相比仍有较大差距。主要原因有以下两方面：1)天然蜘蛛丝蛋白的核心结构域由富含甘氨酸和丙氨酸的高度重复的序列组成。在用异源宿主进行表达时面临着序列不稳定、表达量低、高级结构形成困难(形成包涵体)等问题。2)天然蜘蛛丝的成丝机理和纺丝过程极其复杂，目前尚无法实现体外模拟。因此人工纺丝过程与蜘蛛生理条件相差甚远。总而言之，目前生产的重组蛛丝纤维由于机械性能差、产量低很难用于实际用途。因此，开发用于仿生纤维生产的新型重组蛛丝蛋白，同时通过调控纺丝工艺获得可媲美天然蛛丝的蛋白纤维，具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]技术问题
[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题是，如何提供重组嵌合蛛丝蛋白、生物蛋白纤维、生物蛋白纤维的制备方法，及它们的应用。
[0007]本专利技术通过添加ELP序列可以使重组嵌合蛛丝蛋白可以在细菌表达系统中实现稳定高效及可溶性表达，通过醛基交联可以显著提升人造纤维的机械性能。
[0008]解决方案
[0009]为解决以上技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供重组嵌合蛛丝蛋白，其为下述A1)～A4)蛋白中任一种：
[0011]A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[C
‑
ELP]所示的氨基酸序列单元，其中，C为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP为类弹性蛋白序列，[C
–
ELP]表示C序列和ELP序列串联；m表示[C
–
ELP]序列串联的重复数，m为2
‑
36之间的整数；
[0012]A2)其氨基酸序列包括：在A1)中相邻的氨基酸序列单元之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸；可选地，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个、四个氨基酸；可选地，连接序列为两个氨基酸；可选地，连接序列可以为TS(其为同尾的酶切位点SpeI(A/CTAGT)酶切后的尾部和NheI(G/CTAGC)酶切后的头部，再次连接后(ACTAGC)的编码氨基酸)，由于多个重复单元直接合成具有一定的难度，以酶切位点的方式连接重复单元时就会产生这种连接序列，而且酶切位点是可以根据需求选择的，即TS也可以替换成其它因更换酶切位点产生的序列，一般来说两个氨基酸或四个氨基酸均可以；
[0013]A3)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列；
[0014]A4)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的C端引入天然蛛丝羧基结构域CTD；
[0015]A5)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)或A4)的N端和/或C端引入组氨酸标签。
[0016]SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：
[0017]GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP
[0018]进一步地，m为8
‑
24之间的整数，可选地为8
‑
16之间的整数，可选地为10
‑
14之间的整数，可选地为12；
[0019]进一步地，ELP的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:2：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(VPGXG)
i
(即，类弹性蛋白以VPGXG为重复单元)，其中，X为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地X为赖氨酸；i为SEQ ID NO:2序列串联的重复数，i为1
‑
40之间的整数，可选地i为3
‑
10之间的整数，可选地i为3
‑
8之间的整数，可选地i为4
‑
6之间的整数，可选地i为5。
[0020]故，A1)中，氨基酸序列的表现形式为[GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP
‑
(VPGKG)
j
]m
，m表示C
‑
ELP序列(GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP
‑
(VPGKG)
j
)串联的重复数，m为1
‑
36之间的整数，可选地，m为8
‑
24之间的整数，可选地为8
‑
16之间的整数，可选地为10
‑
14之间的整数，可选地为12；i为1
‑
40之间的整数，可选地i为3
‑
10之间的整数，可选地i为3
‑
8之间的整数，可选地i为4
‑
6之间的整数，可选地i为5。
[0021]进一步地，氨基酸序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，
[0022]GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGPVPGKGVPGKGVPGKGVP GKGVPGKG
[0023]A1)～A5)蛋白可以如下表述：
[0024]A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的氨基酸序列单元，所述氨基酸序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；直接串联时可以采用人工合成方式，或其它可实现的连接方式；
[0025]A2)其氨基酸序列包括：在A1)中相邻的氨基酸序列单元之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸(即相邻的如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列单元中有两个或四个氨基酸)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组嵌合蛛丝蛋白，其为下述A1)～A5)蛋白中任一种：A1)其氨基酸序列包括：m个直接串联的表现形式如[C
‑
ELP]所示的氨基酸序列单元，其中，C为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，ELP为类弹性蛋白序列，[C
–
ELP]表示C序列和ELP序列串联；m表示[C
–
ELP]序列串联的重复数，m为2
‑
36之间的整数；A2)其氨基酸序列包括：在A1)中相邻的氨基酸序列单元[C
‑
ELP]之间连有连接序列，可选地，连接序列包括两个或四个氨基酸；A3)其氨基酸序列包括：A1)或A2)所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失得到的与A1)所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列；A4)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)的C端引入天然蛛丝羧基结构域CTD；A5)其氨基酸序列包括：在A1)或A2)或A3)或A4)的N端和/或C端引入组氨酸标签。2.根据权利要求1所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，m为8
‑
24之间的整数，可选地为8
‑
16之间的整数，可选地为10
‑
14之间的整数，可选地为12；和/或，ELP的氨基酸序列包含若干如SEQ ID NO:2：VPGXG所示的氨基酸序列串联而成的氨基酸序列，表现形式为(VPGXG)
i
，其中，X为赖氨酸或精氨酸或其它氨基酸，可选地X为赖氨酸；i为SEQ ID NO:2序列串联的重复数，i为1
‑
40之间的整数，可选地i为3
‑
10之间的整数，可选地i为3
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8之间的整数，可选地i为4
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6之间的整数，可选地i为5；可选地，氨基酸序列单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。3.根据权利要求1或2所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，A3)蛋白中，天然蛛丝的羧基结构域包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；和/或，A2)蛋白中，所述连接序列为同尾的不同酶切位点酶切后再连接后编码的两个或四个氨基酸。4.根据权利要求1至3任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；或，其为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个、两个或以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID NO:5所示的蛋白质具有相同或相近性质的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白，其特征在于，其通过含有重组表达载体的表达细胞诱导表达获得；可选地，所述重组表达载体为含有编码重组嵌合蛛丝蛋白的基因的pET25b表达质粒；可选地，所述表达细胞为大肠杆菌，可选地，所述表达细胞为大肠杆菌E.coli BLR(DE3)；可选地，通过IPTG诱导表达。6.一种生物蛋白纤维，其特征在于，包括权利要求1至5任一所述的重组嵌合蛛丝蛋白，可选地，所述生物蛋白纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：北京新诚中科技术有限公司，
类型：发明
国别省市：