【技术实现步骤摘要】
本申请涉及mirna检测，特别是涉及一种高通量等温检测mirna的方法和试剂盒。
技术介绍
1、mirnas(microrna)是广泛存在于生物体内大小约21-23个碱基的一类单链内源性非编码rnas，该类rna通过与mrna的3’非翻译区的不完全碱基互补配对来诱导mrna转录后的降解和抑制其翻译，调控机体许多病理学和生理学过程，包括细胞的代谢、分化和凋亡。
2、目前阻碍mirna研究还有一个重要的因素就是mirna的检测方法。这主要是因为mirna的序列较短，在生物体内丰度差异大，各成员之间的序列相似度高缺乏能够使其选择性扩增的共同特征等。
3、迄今为止，已经开发了多种用于检测mirna的技术，但这些方法仍存在着许多不足之处。如最常用的逆转录实时荧光定量pcr技术(rt-qpcr)，该项技术的最大局限是一次只能检测一种mirna，且由于实时荧光定量pcr的准确定量依赖于多个步骤的相互连接，为了获得准确和可重复的结果，需要考虑rna提取、rna完整度、cdna合成、引物设计、扩增子检测和数据统计等因素。微阵列技术也是检测mirna常用的技术，相比较于逆转录实时荧光定量pcr检测mirna，微阵列技术虽可实现高通量检测，但成本较高，且无法检测到低拷贝的mirna，对序列相似的mirna分析的特异性也不太好。此外，测序检测mirna也具有高通量等特点，但对单个样品总mirna测序的价格较高，虽然不同公司的具体价格不同，但单个样品总mirna测序普遍在0.5万以上。这样昂贵的价格，可以作为科学研究使用，但作为疾
4、因此，建立高通量、低成本的高性价比的mirna检测方法仍然是mirna检测
的研究重点。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种新的检测mirna的方法和试剂盒。
2、为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
3、本申请的一方面公开了一种检测mirna的方法包括对待测rna样本进行逆转录，生成cdna；采用针对mirna设计的锁式探针，以cdna为模板进行成环反应，将锁式探针连接成环；采用针对锁式探针的引物结合区设计的延伸引物，对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；延伸引物的5’端连接编码微球，滚环扩增时采用荧光标记的dutp替代dttp；滚环扩增完成后，检测扩增产物的荧光信号，根据编码微球和dutp的荧光标记信号确定待测rna样本的mirna信息。
4、需要说明的是，本申请的mirna检测方法，可以针对不同的mirna设计不同的锁式探针，锁式探针连接成环后，可以利用相同或不同的延伸引物进行滚环扩增，可以实现多个mirna靶标的检测。例如本申请的一种实现方式中，可以实现5个mirna的检测，为mirna检测提供了一种新的高通量、低成本的高性价比的检测方法。
5、优选的，编码微球为荧光编码微球。
6、需要说明的是，荧光编码微球只是本申请的一种实现方式中具体采用的编码微球；可以理解，在本申请专利技术构思下，还可以采用其他的编码微球，例如量子点编码微球、荧光-磁性编码微球、上转换发光编码微球、拉曼光谱编码微球等；只要能够确保每种编码微球具有可识别的唯一性标志即可。在本申请的检测方法中，在同一反应体系中可以同时使用多种编码微球。
7、优选的，延伸引物与编码微球的连接方式为，在延伸引物的5’进行生物素修饰，在编码微球的表面进行亲和素修饰，利用生物素与亲和素的相互作用，将延伸引物与编码微球连接。
8、需要说明的是，利用生物素和亲和素连接延伸引物与编码微球同样也只是本申请的一种实现方式中具体采用的连接方式，不排除还可以采用其他的连接方式，只要能够将延伸引物固定在编码微球上即可。
9、本申请的另一面公开了一种检测mirna的试剂盒，包括针对mirna设计的锁式探针组合，该锁式探针组合由seq id no.1至seq id no.5所示序列的五条锁式探针组成；
10、seq id no.1：
11、5’-aatattggcgctccttcatctatttctcctattcaccttacttacacatagcagcacgt-3’
12、seq id no.2：
13、5’-tgatgttgattgcatttcagtttacggtttagcatttcgcaattttttagcttatcagac-3’
14、seq id no.3：
15、5’-tgtcccggcctgtatatagatcctgatagattatcgattcatctcattcatattgcact-3’
16、seq id no.4：
17、5’-tcgcacccgtacacatcaaactcagcatactacaacaactacaactctcacacagaaa-3’
18、seq id no.5：
19、5’-agactacctgttctattactactctctaaggcatctcgtatcatactttcccagtgttc-3’
20、五条锁式探针的5’端都具有磷酸化修饰。
21、需要说明的是，本申请的mirna检测，其关键之一就是针对mirna检测靶标设计的锁式探针；seq id no.1至seq id no.5所示序列的五条锁式探针，实际上就是依序检测mirna16、mirna21、mirna92、mirna342和mirna199五个mirna靶标的锁式探针。可以理解，锁式探针只是滚环扩增中的其中一种试剂，滚环扩增中的其他试剂可以通过市售购买获得。
22、优选的，本申请的试剂盒还包括分别针对五条锁式探针设计的延伸引物组合，延伸引物组合由seq id no.6至seq id no.10所示序列的五条延伸引物组成；
23、seq id no.6：5’-ttttttttaagtaaggtgaataggagaa-3’
24、seq id no.7：5’-ttttttttaatgctaaaccgtaaactga-3’
25、seq id no.8：5’-tttttttttatcaggatctatatacaggc-3’
26、seq id no.9：5’-ttttttttgttgtagttgttgtagtatg-3’
27、seq id no.10：5’-ttttttttgccttagagagtagtaatag-3’
28、五条延伸引物的5’端都具有生物素修饰。
29、需要说明的是，五条延伸引物是特别针对五条锁式探针设计的，可以另行购买或订制，也可以组装到试剂盒中，以便使用。
30、优选的，本申请的试剂盒还包括针对mirna设计的逆转录引物组，逆转录引物组由seq id no.11至seq id no.15本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测miRNA的方法，其特征在于：包括对待测RNA样本进行逆转录，生成cDNA；采用针对miRNA设计的锁式探针，以所述cDNA为模板进行成环反应，将所述锁式探针连接成环；采用针对所述锁式探针的引物结合区设计的延伸引物，对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码微球为荧光编码微球。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述延伸引物与编码微球的连接方式为，在所述延伸引物的5’进行生物素修饰，在编码微球的表面进行亲和素修饰，利用生物素与亲和素的相互作用，将所述延伸引物与编码微球连接。
4.一种检测miRNA的试剂盒，其特征在于：包括针对miRNA设计的锁式探针组合，所述锁式探针组合由Seq ID No.1至Seq ID No.5所示序列的五条锁式探针组成；
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括分别针对所述五条锁式探针设计的延伸引物组合，延伸引物组合由Seq ID No.6至Seq ID No.10所示序列的五条延伸引物组成；
6.根据权利要求4所述的
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括阳性样本组，所述阳性样本组由miRNA16、miRNA21、miRNA92、miRNA342和miRNA199五条miRNA组成；miRNA16为Seq ID No.16所示序列，miRNA21为Seq ID No.17所示序列，miRNA92为Seq ID No.18所示序列，miRNA342为Seq ID No.19所示序列，miRNA199为Seq ID No.20所示序列；
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括参考测试引物，所述参考测试引物为Seq ID No.21所示序列；
9.根据权利要求4-8任一项所述的试剂盒，其特征在于：还包括编码微球，所述编码微球的表面具有亲和素修饰。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述编码微球为荧光编码微球。
...【技术特征摘要】
1.一种检测mirna的方法，其特征在于：包括对待测rna样本进行逆转录，生成cdna；采用针对mirna设计的锁式探针，以所述cdna为模板进行成环反应，将所述锁式探针连接成环；采用针对所述锁式探针的引物结合区设计的延伸引物，对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码微球为荧光编码微球。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述延伸引物与编码微球的连接方式为，在所述延伸引物的5’进行生物素修饰，在编码微球的表面进行亲和素修饰，利用生物素与亲和素的相互作用，将所述延伸引物与编码微球连接。
4.一种检测mirna的试剂盒，其特征在于：包括针对mirna设计的锁式探针组合，所述锁式探针组合由seq id no.1至seq id no.5所示序列的五条锁式探针组成；
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括分别针对所述五条锁式探针设计的延伸引物组合，延伸引物组合由seq id no.6至seq id no.10所示序列的五条延伸引物组成；
【专利技术属性】
技术研发人员：吕卓璇，张立明，刘婕妤，张利华，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：
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