一种人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基因突变技术领域，尤其涉及IPC C12Q1领域，更具体地，涉及一种人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒。本发明专利技术采用数字PCR法，用于体外定量检测生发中心弥漫大B淋巴瘤(GCB

【技术实现步骤摘要】
一种人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因突变
，尤其涉及IPC C12Q1领域，更具体地，涉及一种人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒。

技术介绍

[0002]在恶性血液肿瘤，如生发中心弥漫大B淋巴瘤(GCB
‑
DLBCL)、滤泡性B细胞淋巴瘤(FL)、急性髓系白血病(AML)中，分别大约有22％
‑
24％、10％和1％的患者携带EZH2
‑
Y646位点突变。该突变一方面可导致组蛋白甲基转移酶EZH2高度活化，催化组蛋白H3在赖氨酸27位的三甲基化修饰(H3K27me3)来介导基因沉默；另一方面通过影响EZH2的转录因子活性来调节下游信号通路，最终导致恶性血液肿瘤的异常增殖和进展。
[0003]2020年，Tazverik是FDA批准的第一款EZH2抑制剂，它是一款“first
‑
in
‑
class”组蛋白赖氨酸甲基转移酶(Histone
‑
Lysine N
‑
methyltransferase)EZH2的抑制剂。通过抑制EZH2，Tazverik能够抑制组蛋白H3赖氨酸27(H3K27)的甲基化，恢复抑癌基因的表达，让B细胞继续分化或者产生细胞凋亡，从而控制肿瘤的生长。该药对于EZH2基因突变阳性患者具有较好的总缓解率，故此对其基因进行突变检测具有重要意义。
[0004]目前，市面上尚无高效、灵敏的试剂盒对临床骨髓标本抽提的DNA进行EZH2基因Y646位点的定量检测。因此，需要开发一种试剂盒，能对临床大量的骨髓标本抽提的DNA进行高效、灵敏、快速、高特异性的检测，从而对患者选择靶向药物的治疗提供参考意见。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术第一方面提供了一种人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒，其组成成分，包括核酸扩增试剂、对照品。
[0006]优选地，所述核酸扩增试剂为EZH2 ddPCR和ddPCR MIX3。
[0007]优选地，所述EZH2 ddPCR为4～200μL；进一步优选地，为96μL。
[0008]优选地，在实际使用过程中，所述EZH2 ddPCR的使用量不小于4μL。
[0009]优选地，所述EZH2 ddPCR和ddPCR MIX3的体积比为1：(2.5～5)。
[0010]优选地，所述EZH2 ddPCR包括EZH2突变型和野生型特异性引物、野生型荧光探针和突变型荧光探针。
[0011]优选地，所述EZH2突变型和野生型特异性引物为
[0012]EZH2
‑
F1：5
’‑
TGGCACCATCTGACGTGGCA
‑3’
、
[0013]EZH2
‑
F2：5
’‑
ATCTGACGTGGCAGGCTGGG
‑3’
、
[0014]EZH2
‑
R1：5
’‑
GAATACAGGTTATCAGTGCC
‑3’
、
[0015]EZH2
‑
R2：5
’‑
AGTATATACAATGCCACCTG
‑3’
中的两种；
[0016]进一步优选地，为
[0017]EZH2
‑
F2：5
’‑
ATCTGACGTGGCAGGCTGGG
‑3’
、
[0018]EZH2
‑
R2：5
’‑
AGTATATACAATGCCACCTG
‑3’
。
[0019]优选地，所述EZH2突变型和野生型特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0020]优选地，所述野生型荧光探针和突变型荧光探针为
[0021]EZH2
‑
WT
‑
P：5
’‑
CTCAGAATACTGTGGAGAGG
‑3’
、
[0022]EZH2
‑
MT
‑
1937
‑
P：5
’‑
CTCAGAATBCTGTGGAGAGG
‑3’
、
[0023]EZH2
‑
MT
‑
1936
‑
P：5
’‑
CTCAGAAMACTGTGGAGAGG
‑3’
。
[0024]优选地，所述荧光探针由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0025]优选地，所述EZH2 ddPCR包括50μM的EZH2突变型和野生型特异性引物和50μM的野生型荧光探针和突变型荧光探针、工艺用水。
[0026]优选地，所述50μM的EZH2突变型和野生型特异性引物、50μM的野生型荧光探针和突变型荧光探针、工艺用水的体积比为3：1：76。
[0027]优选地，所述ddPCR MIX3为热启动酶、dNTPs、MgCl2、缓冲液、微滴稳定剂。
[0028]优选地，所述ddPCR MIX3购自Bio
‑
Rad公司，型号为1863010。
[0029]优选地，所述对照品包括空白对照、阳性对照。
[0030]优选地，所述空白对照为6～100μL工艺用水。
[0031]优选地，所述阳性对照为6～100μL质粒DNA混合液。
[0032]优选地，所述的质粒DNA混合液由1份稀释到10
‑6野生型质粒和2份稀释到10
‑6的突变型质粒组成。
[0033]优选地，所述野生型质粒和突变型质粒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
[0034]本专利技术中，设计EZH2突变型和野生型特异性引物、野生型和突变型荧光探针与样本DNA以及ddPCR MIX3，共同简化体外EZH2基因Y646位点的定量检测的方法，同时提高了检测EZH2基因Y646位点的灵敏性及特异性。本专利技术人创造性的发现，本专利技术中设计的引物和探针能特异性的扩增目的序列和提高扩增效率。合适的引物和探针可以避免背景和非特异产物的产生，同时影响扩增产量。粗糙设计的引物和探针可能会导致目的序列的扩增减少甚至没有，从而降低人EZH2基因Y646位点突变检测试剂盒检测的灵敏度和准确性，难以应用到生产实践中。
[0035]本专利技术第二方面提供了使用人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：样本处理、扩增试剂准备、加样、制备微滴、封膜、PCR扩增、微滴读取、结果分析，结果判定。
[0036]具体步骤为：
[0037]S1：样本处理：用抽提试剂盒对样本进行核酸提取，以此作为PCR反应模板。
[0038]S2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于，其组成成分，包括核酸扩增试剂、对照品。2.根据权利要求1所述的人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂为EZH2 ddPCR和ddPCR MIX3。3.根据权利要求2所述的人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述EZH2 ddPCR包括EZH2突变型和野生型特异性引物、野生型荧光探针和突变型荧光探针。4.根据权利要求3所述的人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述EZH2突变型和野生型特异性引物为EZH2
‑
F1：5
’‑
TGGCACCATCTGACGTGGCA
‑3’
、EZH2
‑
F2：5
’‑
ATCTGACGTGGCAGGCTGGG
‑3’
、EZH2
‑
R1：5
’‑
GAATACAGGTTATCAGTGCC
‑3’
、EZH2
‑
R2：5
’‑
AGTATATACAATGCCACCTG
‑3’
中的两种。5.根据权利要求3所述的人EZH2基因Y646位点突变数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述野生型荧光探针和突变型荧光探针为EZH2
‑
WT
‑
P：5
’‑
CTCAGAATACT...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪祎，朱华渊，李建勇，范磊，秦姝超，孙月，刘姝，熊慧，谢立群，肖晓，李静，
申请(专利权)人：苏州云泰生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：