用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。本发明专利技术试剂盒含有数字PCR反应液和质控品；数字PCR反应液中含有用于检测EB病毒核酸的引物和探针，包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；探针的两端标记有荧光基团。本发明专利技术的试剂盒及检测方法可实现对核酸分子的绝对定量，从而避免了由PCR扩增效率差异所导致的偏差，具有更高的精确度、灵敏性和重复性，易于标准化。

【技术实现步骤摘要】
用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。
技术介绍
人类是EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)惟一天然宿主，EB病毒的全世界人感染率超过90％。原发感染通常发生在幼年时期，并且无症状，表现为隐性感染；但如果感染发生在青少年或成年，则可能导致感染性单核细胞增多症。据报道，我国95％以上人群在3～5岁时已感染了EBV。原发感染后，病毒可以长期持续性存在，呈潜伏感染状态，在大多数病例中无症状。EB病毒主要经唾液传播，但也有报道经血液和性活动传播。EB病毒感染细胞有两种形式：即潜伏性感染和增殖性感染。在潜伏性感染中，病毒以环状游离体和/或整合型形式存在。在一定条件下，如免疫功能低下或某些物理化学因素的作用(紫外线、丁酸、巴豆油及尿嘧啶等)，EB病毒可以从潜伏状态变为增殖状态。我国是鼻咽癌的高发国家，其发病率占头颈部肿瘤的首位。已有大量的实验研究表明，EB病毒与鼻咽癌关联密切，放疗前血浆EBVDNA检测对NPC的临床分期和判断预后有重要的临床意义，放疗结束时血浆EBVDNA检测对残留病灶和总生存判断同样具有重要意义，并对放疗后肿瘤转移复发有监测作用。传统的EB病毒相关抗体的检测是诊断及监测患者病情最常用的方法，但是它的敏感性和特异性较差。目前的荧光定量PCR对原有核酸只能进行相对定量,需要依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，且对病毒是否为阳性的检测存在不确定的检测结果，导致多次检测，或者检测结果不准确。ddPCR技术的引入为直接和真实地反映患者体内病毒复制水平，为我们在肿瘤的诊断、治疗和判断预后方面提供了一种新的非侵入性手段。数字PCR技术是近年兴起的第三代PCR绝对定量技术，与实时荧光定量PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在现阶段的低丰度因子检测中，实时荧光定量PCR技术都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精准定量的要求，而数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，从而提高检测的灵敏度和精确性。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提出一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。本专利技术的又一专利技术目的在于提出一种采用数字PCR检测EB病毒核酸的引物和探针。为了完成本专利技术的目的，采用的技术方案为：本专利技术涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒，所述试剂盒含有数字PCR反应液和质控品；所述数字PCR反应液中含有用于检测EB病毒核酸的引物和探针，所述用于检测EB病毒核酸的引物和探针包括由SEQIDNO:1所示的正向引物、由SEQIDNO:2所示的反向引物、由SEQIDNO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。可选的，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ。可选的，所述数字PCR反应液中还含有数字PCR缓冲液。可选的，所述数字PCR反应液中含有DEPC处理水1～1.5μL、数字PCR缓冲液8～12μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.01～0.02nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.01～0.02nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.005～0.01nmol；优选的，所述数字PCR反应液中含有DEPC处理水1.2μL、数字PCR缓冲液10μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.015nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.015nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.008nmol。可选的，所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为无菌生理盐水，所述阳性质控品含有浓度为5.25×105copies/μL的EB病毒标准质粒溶液，所述EB病毒标准质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。可选的，所述数字PCR试剂盒所适用的样本选自血清或血浆。本专利技术还涉及一种利用所述的数字PCR试剂盒定量检测EB病毒核酸的方法，至少包括以下步骤：(1)采集样品，得到样品采集液；(2)样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品采集液进行提取，得到样品处理液；(3)配制数字PCR反应混合液：将所述数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到数字PCR反应混合液；优选的，所述数字PCR反应液与所述样品处理液的体积比为3：1；(4)将所述数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，然后进行数字PCR扩增反应；(5)读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddPCR反应体系内EB病毒DNA的拷贝数。可选的，所述数字PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温13～16秒、58℃保温58～60秒，共进行39～41个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；优选的，首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15秒、58℃保温60秒，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；更优选的，升降温的速度≤2℃/秒。本专利技术还涉及一种采用数字PCR检测EB病毒核酸的引物和探针，所述引物和探针的序列包括由SEQIDNO:1所示的正向引物、由SEQIDNO:2所示的反向引物、由SEQIDNO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。可选的，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ。本专利技术的技术方案至少具有以下有益的效果：本专利技术的试剂盒及检测方法可实现对核酸分子的绝对定量，从而避免了由PCR扩增效率差异所导致的偏差。本专利技术的试剂盒无需依赖有证标准物质或其他标准品，具有更高的精确度、灵敏性和重复性，易于标准化。本专利技术的试剂盒及检测方法更适合低拷贝数的核酸检测，最低检出量为5.25copies/μL的EB病毒DNA。由于本专利技术采用的数字PCR是终点检测，对抑制剂的耐受度更高，因此本专利技术的试剂盒及检测方法可降低由基质类型所导致的检测偏差。附图说明图1是本专利技术实施例1中提供的实验结果图；其中，横坐标表示循环数(Cyclenumber)，纵坐标表示荧光值(DeltaRn)。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。具体实施方式本专利技术实施例涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法，具有操作简单、结果准确的技术优势。该试剂盒所适用的数字PCR(ddPPCR)系统包括微滴发生器和微滴分析仪及其相关的耗材。微滴发生器可将待本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有数字PCR反应液和质控品；/n所述数字PCR反应液中含有用于检测EB病毒核酸的引物和探针，所述用于检测EB病毒核酸的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有数字PCR反应液和质控品；
所述数字PCR反应液中含有用于检测EB病毒核酸的引物和探针，所述用于检测EB病毒核酸的引物和探针包括由SEQIDNO:1所示的正向引物、由SEQIDNO:2所示的反向引物、由SEQIDNO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。


2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ。


3.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应液中还含有数字PCR缓冲液。


4.根据权利要求3所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR反应液中含有：DEPC处理水1～1.5μL、数字PCR缓冲液8～12μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.01～0.02nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.01～0.02nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.005～0.01nmol；
优选的，所述数字PCR反应液中含有DEPC处理水1.2μL、数字PCR缓冲液10μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.015nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.015nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.008nmol。


5.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品；
所述阴性质控品为无菌生理盐水，所述阳性质控品含有浓度为5.25×105copies/μL的EB病毒标准质粒溶液，所述EB病毒标准质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。


6.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述数字PCR试剂盒所适...

【专利技术属性】
技术研发人员：严晓锋，刘凤麟，熊慧，
申请(专利权)人：苏州云泰生物医药科技有限公司，武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32