用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测乙肝病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法。本发明专利技术的微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；探针的两端标记有荧光基团。本发明专利技术微滴数字PCR试剂盒的特异性好、灵敏度高、能快速检测到极低含量的病毒，而且可直接定量，无需标准曲线。技术操作简便、自动化程度高，为低浓度乙肝病毒检测和定量提供了一种切实可行的方法。

Micro drop digital PCR kit and detection method for quantitative detection of hepatitis B virus

【技术实现步骤摘要】
用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测乙肝病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，乙型肝炎病毒)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。乙型肝炎病毒复制的特点是：肝细胞核内有稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)存在；有一个逆转录步骤。乙型肝炎病毒基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒复制酶(聚合酶)及一种似乎与病毒基因表达有关的蛋白质X。乙肝病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、发病率高、治疗困难等特点。由其引起的乙型病毒性肝炎广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年。人体感染乙肝病毒后常可导致急、慢性乙型病毒性肝炎，长期的慢性感染可发展成肝硬化、甚至肝细胞癌，是一种潜在的严重威协人类健康的传染病。因此要求对乙型肝炎病毒感染尽快针对不同病情给以恰当的治疗。快速灵敏的乙型肝炎病毒检测是及时诊断及治疗的必要条件数字PCR(DigitalPCR-dPCR)技术是最新的核酸检测及定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。其基本原理是，将适度稀释的低浓度核酸样本分装进若干个独立的微反应体系中，由于稀释后靶核酸分子浓度极低，使有些微反应体系中无靶核酸分子，有些微反应体系中含有至少1个靶核酸分子。经过PCR扩增，无靶核酸分子的微反应呈阴性，有靶核酸分子的微反应呈阳性。计数阳性微反应的数量，再结合泊松分布概率密度函数，可得到每个微反应体系中靶核酸分子的平均含量，进而获得样品中靶核酸分子的原始浓度。数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，完全不依赖于Ct值，受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；另外，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。相比于传统的荧光PCR，拥有更加出色的灵敏度、特异性和精确性，其在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异分析方面展现出的优势已被普遍认可。为了应对临床上日益增长的乙型肝炎病毒检测高灵敏度和高准确性检测的需求，开发基于dPCR的乙型肝炎病毒检测方法，具有十分重要的意义。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提出一种用于定量检测乙肝病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。本专利技术的又一专利技术目的在于提出一种采用数字PCR检测乙肝病毒核酸的引物和探针。为了完成本专利技术的目的，采用的技术方案为：本专利技术涉及一种用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒，所述微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，所述微滴数字PCR检测试剂中含有用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物和探针；所述用于检测乙型肝炎核酸的引物和探针包括由SEQIDNO:1所示的正向引物、由SEQIDNO:2所示的反向引物、由SEQIDNO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。可选的，所述探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ。可选的，所述正向引物还选自SEQIDNO:1所示核苷酸的5’端和/或3’端连接有延长的核苷酸片段的核苷酸序列，或者选自与SEQIDNO:1所示核苷酸互补的核苷酸序列；所述反向引物还选自SEQIDNO:2所示核苷酸的5’端和/或3’端连接有延长的核苷酸片段的核苷酸序列，或者选自与SEQIDNO:2所示核苷酸互补的核苷酸序列。可选的，所述微滴数字PCR检测试剂中还含有数字PCR缓冲液。可选的，所述微滴数字PCR检测试剂中含有DEPC处理水用量1～3μL、数字PCR缓冲液8～12μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.01～0.015nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.01～0.015nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.002～0.06nmol；优选的，微滴数字PCR检测试剂中含有DEPC处理水用量2μL、数字PCR缓冲液10μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.013nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.013nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.004nmol。可选的，所述微滴数字PCR试剂盒中还包括微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和铝箔热封膜。本专利技术还涉及一种利用上述的微滴数字PCR试剂盒定量检测乙肝病毒核酸的方法，至少包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA；(2)配制微滴数字PCR反应混合液：将所述微滴数字PCR检测试剂和待测样本DNA模板混合，得到所述微滴数字PCR反应混合液；(3)将所述微滴数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，然后进行PCR扩增反应；(4)读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得微滴PCR反应体系内乙型肝炎病毒DNA的拷贝数。可选的，所述生成微滴的方法至少包括以下步骤：(1)将微滴生成卡固定在卡托中，取8个所述微滴数字PCR反应混合液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内；(2)在微滴发生卡最底下一排8个孔中加入微滴生成油，盖上胶垫；(3)将卡托放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，将生成的微滴转移至96孔板相应位置孔内；(4)使用封膜仪进行封膜，封好膜之后在96孔PCR仪内进行PCR反应。可选的，所述PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温5～7分钟；然后95℃保温10～15秒、60℃保温30～35秒，共进行38～42个循环；最后在98℃条件下保温9～11min，降温至4℃结束反应；优选为，首先在95℃条件下保温5分钟；然后95℃保温10秒、60℃保温30秒，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃结束反应；更优选的，升降温的速度≤2℃/秒。本专利技术还涉及一种采用微滴数字PCR检测乙肝病毒核酸的引物和探针，所述引物和探针的序列包括由SEQIDNO:1所示的正向引物、由SEQIDNO:2所示的反向引物、由SEQIDNO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团；优选的，SEQIDNO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ。本专利技术的技术方案至少具有以下有益的效果：本专利技术微滴数字PCR试剂盒的特异性好、灵敏度高、能快速检测到极低含量的病毒，而且可直接定量，无需标准曲线。技术操作简便、自动化程度高，为低浓度乙肝病毒检测和定量提供了一种切实可行的方法。附图说明图1是本专利技术实施例1中提供的实验结果图；其中，横坐标表示循环数(Cyclenumber)，纵坐标表示荧光值(DeltaRn)。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，/n所述微滴数字PCR检测试剂中含有用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物和探针；所述用于检测乙型肝炎核酸的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，
所述微滴数字PCR检测试剂中含有用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物和探针；所述用于检测乙型肝炎核酸的引物和探针包括由SEQIDNO:1所示的正向引物、由SEQIDNO:2所示的反向引物、由SEQIDNO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。


2.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ。


3.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述正向引物还选自SEQIDNO:1所示核苷酸的5’端和/或3’端连接有延长的核苷酸片段的核苷酸序列，或者选自与SEQIDNO:1所示核苷酸互补的核苷酸序列；
所述反向引物还选自SEQIDNO:2所示核苷酸的5’端和/或3’端连接有延长的核苷酸片段的核苷酸序列，或者选自与SEQIDNO:2所示核苷酸互补的核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR检测试剂中还含有数字PCR缓冲液。


5.根据权利要求4所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR检测试剂中含有DEPC处理水用量1～3μL、数字PCR缓冲液8～12μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.01～0.015nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.01～0.015nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.002～0.06nmol；
优选的，微滴数字PCR检测试剂中含有DEPC处理水用量2μL、数字PCR缓冲液10μL、SEQIDNO:1所示的正向引物0.013nmol、SEQIDNO:2所示的反向引物0.013nmol、SEQIDNO:3所示的探针0.004nmol。


6.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR试剂盒中还包括微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和铝箔热封膜。


7.一种利用权利要求1～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：严晓锋，刘凤麟，熊慧，
申请(专利权)人：苏州云泰生物医药科技有限公司，武汉百泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32