一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法技术

本发明专利技术涉及药物检测领域，具体涉及一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法。该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用苯基己基键合硅胶作为填充剂，采用甲醇

【技术实现步骤摘要】
一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法


[0001]本专利技术涉及药物检测领域，具体涉及一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法。

技术介绍

[0002]核酸药物能够在分子水平调控细胞的基因表达或编码治疗性的功能蛋白，进而实现针对特定疾病靶点的精准治疗。近年来两款mRNA新冠疫苗的获批上市，以RNA为主的核酸药物开启了飞跃式的快速发展，在传染病预防、肿瘤、免疫性疾病及遗传性疾病等领域均取得了大量研究成果。然而，RNA在进入体内后极易被血液循环和机体组织中广泛存在的RNA酶降解失活，半衰期短，同时RNA携带的负电通常导致其入胞困难、转染效率低下，因此RNA药物在体内的有效递送一直是影响其成药性的关键难题。
[0003]脂质纳米粒（lipid nanoparticles, LNP）是核酸药物递送领域较为成熟的递送系统之一，具有生物相容性较好、制备工艺模块化、对核酸药物包封率高的特点。LNP对核酸药物的有效包载不仅能够保护核酸药物在体内不被酶解失活，同时LNP还能通过与细胞膜的膜融合作用介导内吞，进而实现核酸药物的有效胞内递送。但是，LNP的各种脂质组分比例不仅显著影响核酸药物的入胞及转染效率，也会显著影响LNP的安全性和稳定性，LNP通常包含了可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质。
[0004]目前，脂质分析方法主要为高效液相色谱法搭配蒸发光散射检测器（ELSD）或电雾式检测器（CAD），且均为针对上述四种材料进行色谱条件开发及优化，但事实上四种脂质组分的LNP已不能完全满足核酸药物递送系统的研究和开发需求。由于常规四种组分的LNP体系在静脉注射后仅能被动蓄积于肝脏，为了突破基因药物的肝外递送，现已有大量研究通过在此四种组分的基础上引入第五种脂质材料来实现LNP的特定器官靶向递送，如引入阳离子脂质制备肺靶向LNP，引入阴离子脂质制备脾靶向LNP等（Cheng Q , Wei T , Farbiak L , et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue
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specific mRNA delivery and CRISPR
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Cas gene editing[J]. Nature Nanotechnology, 2020, 15(4):1
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8.）；另外，为了提高LNP体系的转染效果，辅助磷脂从磷脂酰胆碱（PC）类脂质材料替换为磷脂酰乙醇胺（PE）类脂质材料，或通过PC和PE的联合使用来调节LNP体系的稳定性和转染效率（Lvarez
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Benedicto E , Farbiak L , Martha M
á
rquez Ram
í
rez, et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA)[J]. Biomaterials Science, 2022, 10.）。
[0005]专利（CN114778712A）公开了一种聚乙二醇脂质以及含有该脂质的脂质纳米粒含量的检测方法，该方法是通过高效液相色谱进行检测，以ChromeCore 300C4 4 . 6
×
250mm；5μm为色谱柱， 0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，虽然该专利在
技术实现思路
描述中提到脂质纳米粒的多种组分检测，但实施例中仅检测了PEG脂质，并未对多种脂质组分同时进行定量检测。
[0006]Kinsey等人提供了一种LNP多种脂质组分的含量检测方法，该方法使用C18色谱
柱，以水
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甲醇
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甲酸
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三乙胺体系为流动相，可以有效的分离和检测出阳离子脂质、PEG、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）和胆固醇四种LNP中的常规脂质组分（Kinsey C, Lu T, Deiss A, Vuolo K, Klein L, Rustandi RR, Loughney JW. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high
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performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. 2022 May;43(9
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10):1091
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1100.），但是目前所需要检测的脂质并不仅限于这几种。
[0007]有文献公开了一种能同时检测PolyEtOx、Chol、DODMA、DOPE、CSL3、DSPE
‑
PEG2000和DSPC七种脂质的检测方法（Mousli Y , Brachet M, Jeanne L C , Ferey L. A rapid and quantitative reversed
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phase HPLC
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DAD/ELSD method for lipids involved in nanoparticle formulations. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2022.），该方法仍然使用的是C18色谱柱，以“三氟乙酸水溶
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甲醇”体系为流动相进行洗脱。但是在本专利技术预试验中发现，将该方法用于同时检测本专利技术中的DSPC、DLin
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MC3
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DMA、SM
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102、DOPE、DMG
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PEG2000、DOTAP、DOPA和胆固醇八种脂质时，八种脂质组分只能检出七种，且各组分的峰分离的度较差（参照对比例1）。
[0008]由于脂质纳米粒中脂质数量及种类的改变，亟需开发出一种能够准确定量多种脂质材料的分析方法，以满足不断创新发展的LNP体系的质量控制需求。

技术实现思路

[0009]为了解决上述问题，本专利技术拟提供一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法，其能够有效的分离检测更多的脂质，色谱峰形好，分离度高，重复性好。
[0010]本专利技术通过使用前述现有技术以外的固定相，与特定的流动相配合，最终解决了上述问题。具体的，本专利技术提供了一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用苯基己基键合硅胶作为填充剂，采用甲醇
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乙酸铵水溶液为流动相A、乙腈
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乙酸铵水溶液为流动相B，进行梯度洗脱 ，梯度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于脂质纳米粒中多种脂质组分定量检测的方法，其特征在于，所述脂质组分包括可电离脂质、磷脂酰胆碱类辅助磷脂、磷脂酰乙醇胺类辅助磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质、阳离子脂质和阴离子脂质中的5种以上；所述检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用苯基己基键合硅胶作为填充剂，采用甲醇
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乙酸铵水溶液为流动相A、乙腈
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乙酸铵水溶液为流动相B，进行梯度洗脱 ，梯度洗脱程序为：。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可电离脂质包括DLin
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MC3
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DMA、SM
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102、DLin
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KC2
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DMA、5A2
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SC8、C12
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200；所述磷脂酰胆碱类辅助磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、1
‑
棕榈酰基
‑2‑
油酰基磷脂酰胆碱POPC；所述磷脂酰乙醇胺类辅助磷脂包括二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺DPPE、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺DMPE、1
‑
棕榈酰基
‑2‑
油酰基磷脂酰乙醇胺POPE；所述聚乙二醇脂质包括1,2
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二肉豆蔻酰
‑
rac
‑
甘油
‑3‑
甲氧基聚乙二醇DMG
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PEG、二硬脂酰
‑
rac
‑
甘油
‑
聚乙二醇DSG
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PEG、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇DSPE
‑
PEG、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇DPPE
‑
PEG、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇DMPE
‑
PEG、二油酰磷脂酰乙醇胺
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚圆，王震宇，许俊鹏，姚倩，邹雪梅，冯博，舒宏，秦莉娜，
申请(专利权)人：四川普锐特药业有限公司，
类型：发明
国别省市：