特基拉芽胞杆菌LMS3及其在防治藜麦黑茎病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株及其发酵液的制备和使用方法，特基拉芽胞杆菌LMS3菌株于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.26794。LMS3菌株发酵液的制备方法，包括制备种子液和制备发酵液。本发明专利技术的特基拉芽胞杆菌LMS3菌剂1000倍稀释后，于8月初对藜麦茎秆部进行喷洒，每隔7

【技术实现步骤摘要】
特基拉芽胞杆菌LMS3及其在防治藜麦黑茎病中的应用


[0001]本专利技术属于植物病害综合防治
，具体涉及一种防治藜麦黑茎病的特基拉芽胞杆菌LMS3菌株以及特基拉芽胞杆菌LMS3菌剂与戊唑醇协同防治藜麦黑茎病的方法。

技术介绍

[0002]藜麦Chenopodiumquinoa又称昆诺阿藜、南美藜等，是印第安人传统食物，有“粮食之母”之称。藜麦因具有高蛋白、高纤维、高维生素和低脂肪、低糖等特点被誉为最适宜人类的全营养食品。但随着藜麦的广泛种植，在其生长过程中各种病害也相继出现，在我国已报道多种藜麦病害发生。其中，藜麦黑茎病是危害藜麦茎部的新病害，2017年在山西忻州市静乐县首次发现，在温度为15~25℃的条件下更容易发生。典型症状是在茎上形成黑色坏死病斑，病斑可完全包裹茎，引起倒伏、籽粒空瘪和不育。引起藜麦黑茎病的为茎生壳二孢Ascochytacaulina，侵染藜麦茎部并产生大量分生孢子，偶见侵染藜麦叶片。藜麦黑茎病在山西静乐的发病率约为80%，目前，生产上对藜麦黑茎病主要使用化学防治的方法。虽然采用杀菌剂防治藜麦黑茎病速度快、效率高、方便简单，但由于农民对该病害缺乏正确认识，盲目使用化学药剂，且藜麦黑茎病发病期主要在藜麦开花期到结穗期，此时对茎秆发病部位喷施杀菌剂，易污染籽粒，影响藜麦品质。
[0003]生物防治作为化学防治的替代手段之一，可以有效减少化学农药的使用。生防菌种类繁多，目前已广泛应用的主要有真菌和细菌。生防细菌包括芽胞杆菌Bacillusspp.、链霉菌Streptomycesspp.等。其中，芽胞杆菌是开发微生物源农药的重要资源之一，目前在生物防治中得到广泛研究和应用。研究证实，从防治病害的寄主植物本身分离得到的植物内生芽胞杆菌相较于其他植物中分离得到的具有更好的定殖能力，可进入寄主植物体内与病原物竞争空间，且由于芽胞杆菌生长速度快，往往能优先占领生态位，这也是芽胞杆菌的生防机制之一。但生物防治也存在防效稳定性差、显效慢、大田防效差等弊端，大多数生防菌还都停留在筛选、鉴定、抑菌物质抗菌分析阶段。因此，还可将生防菌制剂与低剂量的化学农药联用进行植物病害的防治，既能提高生防菌对生态环境的稳定性，同时也能一定程度上减少化学杀菌剂的用量，降低了病原菌抗药性及环境污染等问题。
[0004]试验研究发现，特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3对藜麦黑茎病具有良好的田间防治效果，同时，特基拉芽胞杆菌LMS3菌株与戊唑醇有良好的生物相容性，即戊唑醇与特基拉芽胞杆菌LMS3菌株混配不会对LMS3菌株造成明显影响，将两者联用对藜麦黑茎病具有显著的协同增效作用。田间防效试验证明，将特基拉芽胞杆菌LMS3菌剂与化学杀菌剂混配使用，与实验效果一致，对防治藜麦黑茎病害具有显著的协同增效作用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株以及菌剂的制备和使用方法，并利用特基拉芽胞杆菌LMS3菌剂与戊唑醇协同防治藜麦黑茎病产生了协同增效作用。
[0006]本专利技术的技术方案如下：一株特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株，于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 26794，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0007]所述的特基拉芽胞杆菌LMS3菌株于2019年9月在山西省静乐县种植的藜麦穗部分离筛选到的。该菌株采用NA固体培养基 25℃恒温（光暗各12 h交替）培养48 h，菌落呈乳白色或淡黄色不透明，表面无光泽，略微干燥，边缘不规则，菌落正中间较平坦，四周有明显的皱褶突起（见图1）。通过扫描电镜观察，LS3菌体呈长杆状，其大小约为（0.5~0.9） μm
ꢀ×
（2.0~3.0）μm（见图2）。
[0008]以LMS3基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R对16S rDNA序列进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行测序，得到大小为1468 bp的核苷酸序列。与GenBank中相关菌株16S rDNA序列构建系统发育树，结果表明，菌株LMS3与Bacillus tequilensis菌株序列在系统发育树同一个分支上，因此，LMS3菌株鉴定为特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis（见图3）。
[0009]所述的特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株发酵液的制备方法，包括如下步骤：（1）制备种子液将NA培养基上培养的48 h的LMS3菌株，挑取一环单菌落接种于LB培养液中，25
‑
27℃、170
ꢀ‑
190 r
·
min
‑1振荡培养24
‑
28 h得到特基拉芽胞杆菌LMS3种子液；（2）制备发酵液将步骤（1）制备的种子液与LB培养液按体积比1：100混合，制成发酵液，在25
‑
27℃、转速170
‑
190 r
·
min
‑1、发酵时间72
‑
74 h，发酵液中特基拉芽胞杆菌LMS3活菌体数不少于109cfu/mL。
[0010]所述的NA培养基的配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0。
[0011]所述的LB培养液配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0。
[0012]所述的特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株发酵液的使用方法是：（1）将特基拉芽胞杆菌LMS3菌株的发酵液，按体积比加入发酵液0.5%的木质素磺酸钠作为表面活性剂制成特基拉芽胞杆菌LMS3田间防治菌剂一，将特基拉芽胞杆菌LMS3田间防治菌剂一稀释1000倍稀释后，于8月初对藜麦茎秆部进行喷洒，每隔7
‑
10天用药一次，连续用药3次；（2）首先将特基拉芽胞杆菌LMS3菌株的发酵液稀释1000倍，将戊唑醇原药稀释至戊唑醇终浓度为1.2 g/L，然后把稀释后的特基拉芽胞杆菌LMS3菌株的发酵液和戊唑醇以质量比6:4混合制成特基拉芽胞杆菌LMS3田间防治菌剂二，在8月初对藜麦茎秆部进行喷洒，每隔10天用药一次，连续用药2
‑
3次。
[0013]特基拉芽胞杆菌LMS3抑菌试验及菌药联用田间药效试验1、测定特基拉芽胞杆菌LMS3菌株对藜麦黑茎病致病菌（Ascochytacaulina）的抑制作用
（1）试验方法将特基拉芽胞杆菌LMS3菌株在NA培养基上活化后，接种环挑取一环菌落接种至装有100 mL LB培养液的250 mL三角瓶中，180 r/min，25℃恒温振荡培养24 h，制得种子液。再按1%的接种量转接至LB培养液中，180 r/min，25℃培养48 h，冷冻离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株，于2023年3月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 26794。2.权利要求1所述的特基拉芽胞杆菌（Bacillus tequilensis）LMS3菌株，其发酵液的制备方法，包括如下步骤：（1）菌株种子培养基：特基拉芽胞杆菌LMS3菌株种子的培养基采用NA培养基，所述的NA培养基的配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0；（2）制备种子液：将NA培养基上培养的48 h的LMS3菌株，挑取一环单菌落接种于LB培养液中，25
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27℃、170
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‑1振荡培养24
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28 h后得到LMS3种子液，所述的LB培养液配方是：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0；（3）制备发酵液：将（1）制备的种子液与LB培养液按体积比1：100混合，制成...

【专利技术属性】
技术研发人员：任璐，赵晓军，吕红，秦楠，殷辉，孙江伟，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：