一株耐碱产脲酶生物矿化菌及其筛选获取方法和应用技术

本发明专利技术提供了一株耐碱产高脲酶生物矿化菌及其筛选获取方法和应用，所述耐碱产高脲酶生物矿化菌命名为Sporosarcina pasteurii DC419，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 20222038。通过在耐碱环境下的筛选以及利用脲酶检测法的验证，通过高通量测序对菌株进行鉴定，最后进行生物矿化反应制备得到碳酸钙。本发明专利技术所述的一株耐碱产高脲酶生物矿化菌具有较强耐碱性能，能在碱性环境中进行生物矿化，将钙离子高效转化为碳酸钙，可应用于修复混凝土裂缝。可应用于修复混凝土裂缝。可应用于修复混凝土裂缝。

【技术实现步骤摘要】
一株耐碱产脲酶生物矿化菌及其筛选获取方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一株耐碱产脲酶生物矿化菌及其的筛选获取方法和应用。

技术介绍

[0002]混凝土由于其强度高、变形小、用途多等优势，成为了越来越多土木工程材料的首选，被广泛应用于建筑工程、市政工程、港口和海洋工程等现代土木工程。随着时间的推移，工程中的混凝土结构一些裂缝缺陷逐渐暴露出来。一些特殊的混凝土构件由于长期在含有水分的环境中工作，所以更容易受到水以及水中离子的侵蚀。混凝土中裂缝的存在，提供了离子侵蚀的通道。因此混凝土结构的开裂问题，在土木工程领域是一个普遍存在的难题，混凝土的裂缝修复问题也成为了工程建设和运营管理中的研究重点。
[0003]传统的混凝土结构开裂的处理方式主要是定期维护和维修，常用的修复方法有表面处理法、填充密封法、压力灌浆法等，根据裂缝性状、宽度以及混凝土结构所处环境，一般采用不同的修复手段。这些修复方法大多使用无机材料和有机材料对裂缝进行修补，在工程实践中取得了一定的治理效果，但也存在一系列问题，如修复材料与混凝土之间胶结能力差；有机材料与水泥基材料的和易性不好，耐久性不高，抗老化性能差，并且有机材料含有有害物质，使用过程中会对周围环境造成污染，危害人体健康，工艺复杂，修复成本高，环境友好型的矿化技术成为了新的研究方向。
[0004]在自然界中，微生物对于石灰岩等沉积岩矿物的形成，有着重要的作用。在成岩过程中，微生物矿化的化学反应，并没有给自然环境带来破坏，其环境友好性已经得到充分的证明。在学科交叉发展的今天，土木工程与材料学的研究者开始着眼于生物学的微生物矿化技术，试图用微生物技术为混凝土材料修复和砂土液化等工程问题开辟新的研究方向。另外微生物矿化技术基本上不受混凝土裂缝大小的限制，常规方法不能修复的裂缝，微生物矿化技术都可以有效修复，且环境友好。

技术实现思路

[0005]本专利技术是基于生物矿化菌在混凝土裂缝修复中的应用，目的是提供一株耐碱产脲酶生物矿化菌株。本专利技术生物材料样品保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20222038，分类命名为Sporosarcina pasteurii DC419。
[0006]一方面，本专利技术提供了一株耐碱产脲酶生物矿化菌株，可以在高碱性环境存活并促进钙离子进行钙化反应。
[0007]另一方面，本专利技术提供了筛选和获取一株耐碱产脲酶生物矿化菌株的方法以及用其制备碳酸钙的方法。
[0008]本专利技术是采用如下技术方案实现的：
[0009]本专利技术所述的耐碱产脲酶生物矿化菌的筛选获取方法，具体包括以下步骤：
[0010]步骤1：取土壤样品于南京工业大学某建筑施工场地；
[0011]步骤2：取步骤1中获得的土壤样品进行处理，制成悬浮液，取静置后的上清液加入LB液体培养基进行培养，富集菌株；
[0012]步骤3：取步骤2中长势较好的LB液体培养基发酵液接种至pH为9
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12的LB液体培养基中按梯度进行耐碱筛选培养；
[0013]步骤4：取步骤3中筛选的LB液体培养基发酵液接种至碱性LB固体培养基平板中涂布培养；
[0014]步骤5：取步骤4中平板内单菌落接种至显色筛选固体培养基平板中进行划线培养；
[0015]步骤6：取步骤5中平板内周围变色的单菌落在碱性LB液体培养基中进行培养；
[0016]步骤7：取步骤6中培养基发酵液，采用脲酶活性检测法进行验证；
[0017]步骤8：取步骤6中验证成功的发酵液进行斜面保藏，获取该新菌种。
[0018]其中，步骤1中的样品是从表土层上5cm采集，用无菌抹刀取样，将样品保存在无菌聚乙烯袋中，随后储存在实验室4℃的冰箱中。
[0019]其中，步骤2中所述的土壤样品过20目～50目筛，按10％的接种量与无菌水混合，制成悬浮液。
[0020]其中，步骤2中所述LB液体培养基的组成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸粉和10g/L氯化钠，余量为蒸馏水。固体LB培养基另添加20g/L琼脂粉。
[0021]其中，步骤3中所述pH为9
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12LB液体培养基用4M/L的氢氧化钠溶液调节pH为9、10、11、12。
[0022]其中，步骤4中所述碱性LB固体培养基用4M/L的氢氧化钠溶液调节pH为11。
[0023]其中，步骤5中所述显色筛选固体培养基的组成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L氯化钠、2g/L磷酸氢二钾、2g/L尿素、0.1g/L葡萄糖、4ml/L0.2％酚红和15g/L琼脂粉，余量为蒸馏水，pH为7。
[0024]其中，步骤6中所述碱性LB液体培养基添加2g/L尿素，用4M/L的氢氧化钠溶液调节pH为11。
[0025]其中，步骤2
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8中所述液体培养基以及固体培养基分别在30℃，180r/min恒温摇床和30℃恒温培养箱中培养12h。
[0026]其中，步骤7中所述脲酶活性检测法为1ml发酵液与9ml尿素缓冲溶液在30℃恒温水浴锅中反应三分钟，用电导仪观察电导率是否变化。尿素缓冲溶液为pH＝9的0.05M/L磷酸盐缓冲溶液与1.1M/L的尿素相融配得。
[0027]其中，步骤8中所述斜面培养基的组成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸粉、2g/L尿素、10g/L氯化钠和20g/L琼脂粉，余量为蒸馏水，用4M/L的氢氧化钠溶液调节pH为9。
[0028]本专利技术筛选获取的一株耐碱产脲酶生物矿化菌株进行16s鉴定，具体包括以下步骤：
[0029]步骤1：单菌落培养及获取；
[0030]步骤2：16S核糖体(rDNA)的聚合酶链反应(PCR)扩增；
[0031]步骤3：序列测定与分析。
[0032]其中，步骤1中所述单菌落培养及获取是从保藏的斜面试管中接种至碱性LB固体培养基中进行划线培养。
[0033]其中，步骤2中所述16S核糖体(rDNA)的聚合酶链反应(PCR)扩增采用引物27F(DNA序列5'
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AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
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3')和1492R(DNA序列5'
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GGTTACCTTGTTACGACTT
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3')，PCR总体积50μL：无菌蒸馏水25μL，TaqDNA聚合酶(10U/μL)21μL，27F(10μmol/L)2μL，1495R(10μmol/L)2μL。聚合酶链反应(PCR反应)条件:95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环；72℃最终延伸10min。
[0034]其中，步骤3中所述PCR产物测序工作由上北京擎科生物科技有限公司完成。拼接完成后的序列如SEQ ID NO.1所示，在线与美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的GenBank中的已知序列比对。
[0035]SEQ ID NO.1：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株耐碱产脲酶生物矿化菌，其特征在于：所述生物矿化菌命名为Sporosarcina pasteurii DC419，该菌株能够在碱性环境下进行生物矿化反应，促进钙离子转化为碳酸钙；菌种保藏编号为CCTCC NO：M 20222038，于2022年12月23日在中国典型培养物保藏中心保藏。2.权利要求1所述的一株耐碱产脲酶生物矿化菌的筛选获取方法，其特征在于：具体包括以下步骤：步骤1：取建筑施工场地土壤样品；步骤2：取步骤1中获得的土壤样品进行处理，制成悬浮液，取静置后的上清液加入LB液体培养基进行培养，富集菌株；步骤3：取步骤2中长势较好的LB液体培养基发酵液接种至pH为9
‑
12的LB液体培养基中按梯度进行耐碱筛选培养；步骤4：取步骤3中筛选的LB液体培养基发酵液接种至碱性LB固体培养基平板中涂布培养；步骤5：取步骤4中平板内单菌落接种至显色筛选固体培养基平板中进行划线培养；步骤6：取步骤5中平板内周围变色的单菌落在碱性LB液体培养基中进行培养；步骤7：取步骤6中培养基发酵液，采用脲酶活性检测法进行验证；步骤8：取步骤7中验证成功的发酵液进行斜面保藏，获取该菌种。3.根据权利要求2所述的一株耐碱产脲酶生物矿化菌的筛选获取方法，其特征在于：步骤1中所述的土壤样品是从表土上5cm采集，用无菌抹刀取样，样品保存在无菌聚乙烯袋中，储存在实验室4℃的冰箱中。4.根据权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：马江锋，李南骏，韩丽婷，张大长，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：