一种高产褐藻胶裂解酶的细菌及应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物发酵，具体的说一种高产褐藻胶裂解酶的细菌及应用。菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，已于2022年9月13日，经中国普通微生物保藏中心保存，保存号为CGMCC No.25691。本发明专利技术提供的高产褐藻胶裂解酶的菌株及其发酵方法，可用于褐藻胶及其衍生物的酶法生产和高值利用，广泛用于食品、保健品、医用材料等领域，具有广阔的市场应用前景。具有广阔的市场应用前景。具有广阔的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高产褐藻胶裂解酶的细菌及应用


[0001]本专利技术涉及微生物发酵，具体的说一种高产褐藻胶裂解酶的细菌及应用。

技术介绍

[0002]褐藻胶是褐藻细胞壁的组成物质，也是两种单糖组成的线形多糖。两种单糖分别为β
‑
D
‑
甘露糖醛酸(M)和α
‑
L
‑
古罗糖醛酸(G)，他们以C5差向异构体存在。糖环结构的上方为甘露糖醛酸，下方为古洛糖醛酸中五号位碳上的羧基。褐藻胶是褐藻细胞壁的重要组分，具有分子质量大、高聚合度、高黏度及高纤维性等特征，因而人体吸收利用程度差，很大程度上限制了使用范围。通过糖苷键水解或生物有机合成获得的低分子量的褐藻寡糖，变成可吸收利用的有效成分。褐藻胶的降解产物—褐藻寡糖所具有的免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抑菌、抗病毒能力等生物活性，在医药界具有很大的潜在价值。褐藻寡糖不仅分子量小，黏性小、稳定性强、易于吸收、安全环保，还具有广泛的生物活性，在众多领域有广泛的应用前景。
[0003]褐藻胶裂解酶是一种专一水解氨基葡萄糖间的β
‑
1，4
‑
糖苷键的酶，在食品、医药及公共卫生等领域都有广泛的应用。根据褐藻胶裂解酶在底物上的酶切位点不同将其分为外切酶和内切酶。褐藻胶裂解酶广泛存在于真菌、细菌和植物中，主要来源于细菌，但在真菌中却报道较少，与真菌相比，细菌中的褐藻胶裂解酶具有高效性、易获得、成本低、适宜工业化生产的优点，如细菌酶蛋白具有较高稳定性，菌丝体易与酶蛋白分离，酶种类多样等。现阶段在自然界中筛选到的初始菌株，产酶量及酶活性都普遍较低，需对其培养基成分和发酵条件进行优化研究，以满足实际应用需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种高产褐藻胶裂解酶的细菌及应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：
[0006]一种高产褐藻胶裂解酶的细菌，菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，已于2022年9月13日，经中国普通微生物保藏中心保存，保存号为CGMCC No.25691。
[0007]一种高产褐藻胶裂解酶的细菌的应用，所述菌株在高产褐藻胶裂解酶中的应用。
[0008]一种产褐藻胶裂解酶的制剂，含所述的菌株。
[0009]所述制剂含有该菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。
[0010]将所述菌株按1
‑
10％(体积比)接种量于发酵培养基中于25
‑
40℃、发酵体系pH为6
‑
7.5条件下发酵培养所得。
[0011]所述每升培养基中加入海藻酸钠5
‑
15g，蛋白胨1
‑
12g、NaCl 5g、KH2PO41g、MnSO4·
7H2O 0.5g、CaCl
2 0.2g。
[0012]一种制剂的应用，所述制剂在酶解褐藻门藻类制备活性多糖中的应用。本专利技术所具有的优点：
[0013]本专利技术从土壤中筛选获得的高产褐藻胶裂解酶的细菌为类芽孢杆菌，该菌利用改
良的发酵培养基(海藻酸钠1.0％(质量体积比)，蛋白胨0.7％、NaCl 0.5％、KH2PO
4 0.1％、MnSO4·
7H2O 0.05％、CaCl
2 0.02％)和发酵条件(pH7.0，温度32℃)进行生产，酶活力可达214U/mL。本专利技术提供的高产褐藻胶裂解酶的菌株及其发酵方法，可用于和褐藻胶及其衍生物的酶法生产和高值利用，可广泛用于食品、保健品、医用材料等领域。具有广阔的市场应用前景。
附图说明
[0014]图1为本专利技术菌株生长与产酶曲线。
[0015]图2为本专利技术菌株发酵条件的响应面优化效果图；其中a：氮源浓度与温度；b：碳源浓度与氮源浓度；c：温度与氮源浓度。
[0016]图3为本专利技术实施例提供的褐藻寡糖薄层层析图。
具体实施方式
[0017]以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。
[0018]实施例1：高产褐藻胶裂解酶菌株的筛选与鉴定
[0019]样品预处理：取土壤5g，加入95mL去离子水，放入300mL锥形瓶中28℃、170r/min摇瓶振荡培养2h。
[0020]菌株的筛选：取上述样品上清液加入装有100mL富集培养基(富集培养基(g/L)：海藻酸钠10.0g、蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、NaCl5.0 g，pH7.0)的300mL摇瓶中，28℃、170r/min条件下摇瓶培养24h。将所得的发酵液梯度稀释后涂布于以海藻酸钠为唯一碳源的筛选培养基上，30℃恒温培养2
‑
3d。平板用革兰氏碘显色处理，挑取透明圈较大的菌落在筛选培养基上多次划线进行菌株纯化。纯化后的菌株接种于种子培养基中，28℃、170r/min摇瓶培养24h，取2％的种子液接入发酵培养基中摇瓶培养48h。发酵液在4℃、10000r/min离心5min，上清液作为粗酶液，通过DNS法测定其中褐藻胶裂解酶酶活力。
[0021]由上述培养获得菌株，其在固体培养基上形成白色、圆形、不透明菌落，菌落边缘平整，表面粗糙且有纹路凸起。
[0022]提取复筛获得的褐藻胶裂解酶产生菌的DNA基因组，对其进行16SrDNA片段扩增，并将扩增得到的序列送至公司测序。经Genebank对比，该细菌与Paenibacillus elgii 16SrDNA序列一致性为95.78％，命名为Paenibacillus PLT1。
[0023]所得褐藻胶裂解酶菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，已于2022年9月13日，经中国普通微生物保藏中心保存，保存号为CGMCC No.25691。实施例2：生长及产酶特性的研究
[0024]取褐藻胶裂解酶菌株保存液放入种子培养基(g/L)(海藻酸钠10g，蛋白胨7g、NaCl 5g、KH2PO41g、MnSO4·
7H2O 0.5g、CaCl20.2g，余量为水，pH 7)中活化1天，1天后按照2％(体积百分比)的接种量将种子液接种入发酵培养基(g/L)(海藻酸钠10g，蛋白胨7g、NaCl 5g、KH2PO41 g、MnSO4·
7H2O 0.5g、CaCl20.2 g，余量为水，pH 7)中，发酵2天，每6小时测定一次酶活和生物量，以时间为横坐标，以酶活(U/mL)、生物量为纵坐标，绘制生长和产酶曲线(图例1)。当发酵时间在0h
‑
12h时，酶活和生物量缓慢上升；当发酵时间在12h
‑
48h时，发酵液酶
活和迅速增加，菌体进入对数生长期；当发酵时间到48h时，该菌株酶活和生物量均达到最大值；当发酵时间在48h
‑
72h时，酶活和生物量保持稳定，菌体进入平稳期；超过72h，菌株生长进入衰亡期，酶活下降。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产褐藻胶裂解酶的细菌，其特征在于：菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，已于2022年9月13日，经中国普通微生物保藏中心保存，保存号为CGMCC No.25691。2.一种权利要求1所述的高产褐藻胶裂解酶的细菌的应用，其特征在于：所述菌株在高产褐藻胶裂解酶中的应用。3.一种产褐藻胶裂解酶的制剂，其特征在于：含权利要求1所述的菌株。4.按权利要求3所述的产褐藻胶裂解酶的制剂，其特征在于：所述制剂含有该菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。5.按权利要求3所述的产褐藻胶裂解酶的制剂，其特征在于：将所述菌株按1
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【专利技术属性】
技术研发人员：焦绪栋，秦松，李莉莉，李梦，王坤阳，温少红，
申请(专利权)人：中科肽谷山东生命科学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：