一种β-酮硫解酶突变体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
酮硫解酶突变体及其构建方法


[0001]本专利技术涉及一种β
‑
酮硫解酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。

技术介绍

[0002]己二酸(adipic acid)又称肥酸，是一种重要的平台化合物，当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6,6)。工业上己二酸的生产路线主要通过硝酸对环己醇—环己酮的混合物(醇酮油，也称KA油)进行氧化制取。但是该方法具有工艺流程长、副产物多、产品收率低、工业“三废”排放严重等问题，特别是温室气体的排放量十分大。因此，人们迫切需要寻找一种能替代传统化学合成己二酸的方法。随着生物技术的发展，全生物合成法生产有机酸具有生产成本低，生产工艺简单，污染小，产品纯度高等优势，所以该方法越来越受人们青睐。
[0003]专利技术人团队前期研究中获得了一株可以将多种碳源转化成己二酸的高产菌株。基于生物信息学、转录组学和代谢组学分析，发现3
‑
氧代己二酰辅酶A途径为己二酸的合成途径(如图1)，包括：Tfu_0875(β
‑
酮硫解酶，β
‑
ketothiolase)，Tfu_2399(3
‑
羟酰基
‑
辅酶A脱氢酶，3
‑
hydroxyacyl
‑
CoA dehydrogenase)Tfu_0067(3
‑
羟基己二酰脱氢酶，3
‑
hydroxyadipyl
>‑
CoA dehydrogenase)，Tfu_1647(5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶A还原酶，5
‑
carboxy
‑2‑
pentenoyl
‑
CoA reductase)以及Tfu_2577和Tfu_2576(succinyl
‑
CoA synthase，琥珀酰辅酶A合成酶)。将该途径的六种基因导入到大肠杆菌中，同样也获得了己二酸的积累。另一方面，作为已报到最高产的己二酸合成途径中的初始步骤—β
‑
酮硫解酶(Tfu_0875)也可用于克莱森缩合反应。但该酶的催化能力有限，因此需要开发酶活能力提高的β
‑
酮硫解酶。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种β
‑
酮硫解酶突变体，是在出发序列的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，或将第221位谷氨酸突变为甘氨酸，或将第249位天冬酰胺突变为色氨酸。
[0005]在一种实施方式中，所述出发序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]在一种实施方式中，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的β
‑
酮硫解酶的第163位的亮氨酸突变为组氨酸，获得如SEQ ID NO.2所示的突变体Tfu_0875
L163H
。
[0007]在一种实施方式中，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的β
‑
酮硫解酶的第221位谷氨酸突变为甘氨酸，获得如SEQ ID NO.3所示的突变体Tfu_0875
E221G
。
[0008]在一种实施方式中，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的β
‑
酮硫解酶的第249位天冬酰胺突变为色氨酸，获得如SEQ ID NO.2所示的突变体Tfu_0875
N249W
。
[0009]在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～4任一所示。
[0010]本专利技术还提供了编码所述突变体的基因。
[0011]在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～8任一所示。
[0012]本专利技术还提供了表达所述β
‑
酮硫解酶突变体的重组微生物细胞。
[0013]在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。
[0014]本专利技术还提供了表达所述β
‑
酮硫解酶突变体的方法，所述方法是将所述重组微生物细胞在培养基中培养一段时间，收集β
‑
酮硫解酶突变体。
[0015]在一种实施方式中，所述培养是在35～37℃培养至OD 600
＝0.6～0.8时，加入终浓度0.03～0.05mM的IPTG(异丙基硫代
‑
β
‑
D半乳糖苷)进行诱导，并在24～26℃摇床继续培养发酵12h。
[0016]在一种实施方式中，所述培养基包括但不限于LB培养基。
[0017]本专利技术还提供了提高β
‑
酮硫解酶活力的方法，是将β
‑
酮硫解酶第163位的亮氨酸突变为组氨酸，或将第221位谷氨酸突变为甘氨酸，或将第249位天冬酰胺突变为色氨酸。
[0018]本专利技术还提供所述β
‑
酮硫解酶突变体在催化合成乙酰化化合物方面的应用。
[0019]在一种实施方式中，所述应用包括但不限于催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A。
[0020]有益效果：本专利技术利用基因工程和酶工程手段，在不影响β
‑
酮硫解酶Tfu_0875酶学性质的基础上提高了β
‑
酮硫解酶Tfu_0875的酶活。在适当的培养条件下，突变体Tfu_0875
L163H
、Tfu_0875
E221G
、Tfu_0875
N249W
缩合乙酰辅酶A的能力是野生酶β
‑
酮硫解酶Tfu_0875的4.13倍、2.52倍、3.12倍。
附图说明
[0021]图1为突变体相对于野生型β
‑
酮硫解酶的酶活。
具体实施方式
[0022]酶活测定方法：利用Ellman试剂(5,5'
‑
二硫代双
‑
(2
‑
硝基苯甲酸))(DTNB)与游离CoA的
‑
SH结合形成黄色化合物，引起412nm处吸光度的增加。
[0023]酶活力测定步骤：
[0024]预热：反应体系中含有10uL 50mM Tris
‑
HCL缓冲液(pH 7.4)、5uL 40mM KCl、20uL1mg/mL乙酰CoA和25uL 10mg/mL纯化的β
‑
酮硫解酶Tfu_0875，置于37℃水浴锅中预热10min。
[0025]反应：将反应液和酶液混合后振荡均匀，向上述混合液中加入0.05mM DTNB溶于50mM磷酸氢二钠(pH 7.0)，监测吸光度变化。30min后终止反应。
[0026]测量：将上述混合液吸取至酶标板中在412nm波长下测定吸光值并计算酶活。
[0027]酶活的定义：每分钟β
‑
酮硫解酶Tfu_本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
‑
酮硫解酶突变体，其特征在于，在出发序列的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，或将第221位谷氨酸突变为甘氨酸，或将第249位天冬酰胺突变为色氨酸。2.根据权利要求1所述的β
‑
酮硫解酶突变体，其特征在于，所述出发序列如SEQ ID NO.1所示。3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.6～8任一所示。5.携带权利要求3或4所述基因重组质粒。6.表达权利要求1或2所述β
‑
酮硫解酶突变体的重组微生物细胞。7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，周胜虎，刘丽霞，毛银，赵运英，李国辉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：