鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用，涉及生物技术领域。该鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白包括PLPFP蛋白，所述PLPFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。且本发明专利技术PLPFP重组蛋白的制备流程简单、成本低廉、易于重复，适合大规模生产，且产物成分简单，相对而言安全性较高。相对而言安全性较高。相对而言安全性较高。

【技术实现步骤摘要】
鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种非发酵型、需氧的革兰氏阴性杆菌，可正常定植于人体，属于条件致病菌。在自然界及医院均广泛分布，尤其是医院的ICU病房及呼吸科，常见的研究用鲍曼不动杆菌菌株的来源均为医院。常引起多种感染如肺炎、伤口感染、脑膜炎、尿路感染、皮肤及软组织感染、心内膜炎等，病情严重时可导致败血症，其死亡率可高达70%。据中国细菌耐药检测网（CHINET）2021年来自全国各省市共71家医院的数据统计显示，30万株临床分离菌株中，鲍曼不动杆菌排第五，占比7.28%，其中呼吸道标本和脑脊液标本来源的菌株中占比排第二，分别高达14.1%和11.3%。
[0003]随着抗生素药物的广泛使用甚至滥用，临床分离的鲍曼不动杆菌菌株耐药性逐渐增强，甚至出现了多重耐药株（MDR），对常见的抗菌药物具有耐药性，包括头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类等，使临床对鲍曼不动杆菌感染的治疗困难重重。多数鲍曼不动杆菌菌株对多粘菌素类和替加环素保持敏感，但在临床的治疗效果仍不理想。因此，一种能有效干预鲍曼感染的手段亟待研发。疫苗是防控鲍曼不动杆菌感染的有效手段，其中亚单位疫苗作为一种疫苗形式，其组分明确，安全性好，辅以合适的佐剂可以获得有效的免疫保护，是一种有转化前景的疫苗形式，研发有效的亚单位疫苗，需要有有效的重组蛋白作为疫苗的抗原成分。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用，本专利技术的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白包括马铃薯糖蛋白样磷脂酶家族蛋白（patatin
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like phospholipase family protein，PLPFP）（GenBank: QKY25916.1）。PLPFP是专利技术人利用反向疫苗学，从鲍曼不动杆菌菌株基因组序列中筛选出来的可作为疫苗候选疫苗抗原之一。编码PLPFP的基因序列全长933个核苷酸，该蛋白具有311个氨基酸，蛋白分子量约33.5 kDa。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白，包括PLPFP蛋白，所述PLPFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]根据一种优选实施方式，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]第二方面，本申请提供了编码上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的多核苷酸。
[0008]第三方面，本申请提供了上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）根据鲍曼不动杆菌PLPFP蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基
因组DNA为模板，根据所设计的PCR引物对编码鲍曼不动杆菌的PLPFP蛋白氨基酸序列的目的基因片段进行PCR扩增；其中，所设计的PCR引物的正向引物：5'
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CGCGGATCCATGGTGTTGGCCGGGTG
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3'，反向引物：5'
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TTATGCGGCCGCTTATTGCGTTTGCGCACTTAA
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3'；（2）将步骤（1）所得的PCR扩增产物克隆至含有GST标签的表达载体，并转化至原核表达系统重进行诱导表达含有GST标签的PLPFP融合蛋白；（3）使用酶切方法将目的蛋白和GST标签分开，获得鲍曼不动杆菌的PLPFP重组蛋白。
[0009]第四方面，本申请还提供了一种表达载体，所述表达载体包括编码上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的多核苷酸，所述表达载体为pGEX
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6P
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2质粒。
[0010]第五方面，本申请提供了一种宿主细胞，包括上述的表达载体。
[0011]根据一种优选实施方式，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
[0012]第六方面，本申请提供了上述鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白在制备治疗或预防鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
[0013]根据一种优选实施方式，所述药物为鲍曼不动杆菌疫苗。
[0014]第七方面，本申请提供了鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
[0015]基于上述技术方案，本专利技术的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白、制备方法及应用至少具有如下有益效果：（1）PLPFP蛋白的表达质粒在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达，表达量高，质量安全可控。
[0016]（2）选择pGEX
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6P
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2表达载体，PLPFP重组蛋白以融合蛋白可溶形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象。
[0017]（3）所表达的融合蛋白中就含有一个GST 标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
[0018]（4）利用本专利技术PLPFP重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过肌肉注射途径进行免疫接种，激发机体产生高效价的IgG抗体。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的多价亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0020]图1为PLPFP基因片段的PCR扩增结果图；图2为表达载体pGEX
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‑2‑
PLPFP的酶切鉴定结果图；图3为重组质粒pGEX
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6p
‑2‑
PLPFP测序与目的蛋白的DNA序列比对结果图；
图4为pGEX
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6P
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PLPFP/BL21（DE3）表达菌株经16℃小量诱导表达后，鉴定GST
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PLPFP重组蛋白的表达情况图；图5为pGEX
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6P
‑2‑
PLPFP/BL21（DE3）表达菌株在诱导表达后，上清中获得含GST融合蛋白，即GST
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PLPFP，并用PP蛋白酶将GST标签切除后获得的PLPFP重组蛋白图；图6 为诱导表达的重组蛋白PLPFP经过阴离子交换柱纯化后的蛋白电泳凝胶考马斯亮蓝染色结果图。
具体实施方式
[0021]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白，其特征在于，包括PLPFP蛋白，所述PLPFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.编码权利要求1所述的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的多核苷酸。3.权利要求1所述的鲍曼不动杆菌PLPFP重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据鲍曼不动杆菌PLPFP蛋白基因序列设计PCR引物，以鲍曼不动杆菌的全基因组DNA为模板，根据所设计的PCR引物对编码鲍曼不动杆菌的PLPFP蛋白基因序列的目的基因片段进行PCR扩增；其中，所设计的PCR引物的正向引物：5'
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CGCGGATCCATGGTGTTGGCCGGGTG
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3'，反向引物：5'
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TTATGCGGCCGCTTATTGCGTTTGCGCACTTAA
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3'；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彦，王宁，谢雨，石云，陈凯，孙向成，游瑜，周杨杨，向传英，张晓敏，杨红，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：