一种L-精氨酸-甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用


[0001]本专利技术涉及一种L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶及其在生产胍基乙酸中的应用，属于酶工程


技术介绍

[0002]胍基乙酸(GAA)是一种天然存在的氨基酸衍生物，其作为肌酸的直接前体，可在需要高能量的组织中充当肌酸源。由于其在水溶液中的成本效益和高稳定性以及与肌酸相比的非特异性转运特性，GAA已被研究为营养添加剂。通过补充GAA，可以恢复以低脑肌酸和肌酸合成功能酶机制为特征的疾病中的细胞生物能量，包括神经退行性疾病、脑肿瘤或脑血管疾病。此外，GAA不具有诱变或基因毒性问题，不会对环境造成风险。鉴于GAA的广泛应用，其工业需求很大。
[0003]目前，GAA主要通过甘氨酸或甘氨酸钠与鸟苷酰化剂(如O
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烷基异脲或氰胺)反应进行化学合成，生产过程需要高温高压，对环境不友好。此外，其纯化过程非常繁琐，容易被初始的酰化剂或有毒物质污染。因此，依靠生物技术，利用可再生资源生产GAA是非常理想的。
[0004]研究发现，在L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC：2.1.4.1)的催化作用下，可以精氨酸和甘氨酸为底物生产胍基乙酸和鸟氨酸。由于此酶存在于大多数动物以及极少数原核生物中，因此在微生物中对此研究较少，同时发现该酶在微生物中可溶性表达较少，易受到鸟氨酸的抑制作用。因次，利用酶法产胍基乙酸仍有许多限制，转化率与产量较低，仍需要进一步挖掘探究。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术通过筛选不同来源的L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶(AGAT)，并通过相关性质的测定，筛选得到催化能力较好的L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶AkAGAT。通过对其进行突变改造，提高其酶活，并将其导入宿主菌，得到大肠杆菌工程菌进行胍基乙酸的生产。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶，所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的酶的第225位苏氨酸突变为谷氨酰胺。
[0007]进一步地，所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶还包括将第258为丙氨酸突变为脯氨酸。
[0008]进一步地，所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶还包括将第278位亮氨酸突变为赖氨酸。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供编码所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶的基因。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组表达载体。
[0011]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶的重组菌。
[0012]进一步地，所述重组菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET
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28a质粒为表达载体。
[0013]本专利技术的第五个目的是提供一种生产胍基乙酸的方法，是以所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶或所述重组菌为催化剂，催化精氨酸和甘氨酸反应生产胍基乙酸。
[0014]进一步地，在以重组菌为催化剂的催化反应体系中，以0.08～0.12M Tris
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HCl为缓冲液，重组菌的菌体量按照OD
600
为30～50添加。
[0015]进一步地，所述催化反应体系中，精氨酸含量为50～200mM，甘氨酸含量为50～200mM，且精氨酸：甘氨酸＝1:2～2:1。
[0016]进一步地，所述催化反应体系中，添加了质量百分比为0.5～2％的曲拉通。
[0017]进一步地，催化反应的温度为30～40℃，初始pH 7～8。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]本专利技术通过选择不同来源的L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶，经过酶活比较，筛选出较高酶活的AGAT酶。将最优酶活的L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶进行突变，筛选得到酶活提高的突变酶AkAGAT
T225Q/A258P/L278K
，该突变酶可溶性表达量提高，催化活性相较于原始酶提高了45.6％，突破了原来酶法产胍基乙酸效率低下的缺点。
[0020]本专利技术将筛选获得的L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶突变体用于生产胍基乙酸，通过优化全细胞催化条件，在1L体系中，将得到的菌株用于转化生产GAA，反应24h，最终产量可达21.4g/L，较原始酶生产胍基乙酸提高了49.6％。
附图说明：
[0021]图1为实施例1中pET
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28a
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AkAGAT、pET
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28a
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AcAGAT、pET
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28a
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CrAGAT构建验证结果电泳图谱；
[0022]图2为实施例1中不同来源L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶AGAT的SDS
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PAGE图，泳道1，2分别为pET
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28a空质的沉淀与粗酶液，泳道3，4分别为pET
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28a
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AkAGAT的沉淀与粗酶液，泳道5，6分别为pET
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28a
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AtAGAT的沉淀与粗酶液，泳道7，8分别为pET
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28a
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CrAGAT的沉淀与粗酶液；
[0023]图3为实施例2中温度对AkAGAT酶活性的影响；
[0024]图4为实施例2中不同金属离子对AkAGAT酶活性的影响；
[0025]图5为实施例2中AkAGAT酶的温度稳定性探究；
[0026]图6为实施例2中AkAGAT酶的酸碱稳定性探究；
[0027]图7为实施例3中AkAGAT突变体的SDS
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PAGE图，泳道1，2，3，4分别为AkAGAT、AkAGAT
T225Q
、AkAGAT
T225Q/A258P
、AkAGAT
T225Q/A258P/L278K
纯酶；
[0028]图8为不同AkAGAT突变体全细胞转化产胍基乙酸比较；
[0029]图9为转化体系中不同底物浓度对GAA生产的影响。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶，其特征在于，所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶是将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的酶的第225位苏氨酸突变为谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶，其特征在于，所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶还包括将第258为丙氨酸突变为脯氨酸。3.根据权利要求1所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶，其特征在于，所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶还包括将第278位亮氨酸突变为赖氨酸。4.编码权利要求1～3任一项所述L
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精氨酸
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甘氨酸脒基转移酶的基因。5.一种携带权利要求4所述基因的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐美娟，饶志明，廖雅芯，胥昊霏，张显，杨套伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：