本发明专利技术提供了一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用，涉及变异或遗传工程领域。具体的，本发明专利技术提供了一种甲基转移酶突变体，该突变体蛋白质包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变：第58位、第203位，其中各氨基酸位置编号由参比序列定义，参比序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术以耻垢分枝杆菌来源的EgtD酶为初始菌株，利用酶的晶体结构分析，从活性中心位点中筛选出相关位点，共构建16株突变株，最后筛选获得了EgtD酶活提高的关键氨基酸位点和能够高效合成麦角硫因的工程菌，该突变能够使EgtD酶活性提高39％，将麦角硫因产量提高10％。10％。10％。
【技术实现步骤摘要】
一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用
[0001]本申请涉及变异或遗传工程领域，尤其涉及一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用。
技术介绍
[0002]甲基转移酶（EgtD）是麦角硫因合成的关键酶。2010年，Seebeck. F P将来源于耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）的egtABCDE等酶的基因在大肠杆菌中重组表达，实现了大肠杆菌体内合成麦角硫因(Florian P.Seebeck，JACS,2010,132,6632
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6633)。EgtD酶负责将S
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腺苷甲硫氨酸的甲基转移至组氨酸，生成组氨酸甜菜碱，是麦角硫因合成的第一步。2015年，Vit等对EgtD进行表征，该酶对底物组氨酸的转化数只有0.58 s
‑1(Misson, Laetitia, Chembiochem: A European journal of chemical biology, 2015.)，是代谢通路中活性最高的EgtE酶活性的2.3%。因此，EgtD是麦角硫因合成的关键限速步骤。2015年，Vit等将来源于耻垢分枝杆菌的麦角硫因合成的关键酶EgtD进行结构解析（PDB 4PIN）(Misson, Laetitia, Chembiochem: A European journal of chemical biology, 2015.)，获得EgtD及其底物的结构复合物，对EgtD酶活性中心进行改造，突变体E285A，E252A/E285A，但这些突变体均未提高组氨酸甲基转移酶活性。
[0003]目前为止，还没有通过改变氨基酸提高EgtD酶活的案例。因此，亟需一种高酶活的EgtD，以解决甲基转移酶酶活较低，不符合工业化生产要求的问题。
技术实现思路
[0004]麦角硫因的合成反应的第一步为组氨酸在甲基转移酶的催化下合成组氨酸甜菜碱，该步骤是麦角硫因合成步骤中的重要限速步骤。由于目前文献和专利中报道的甲基转移酶酶活较低，均不符合工业化生产的要求。
[0005]因此，本专利技术通过对甲基转移酶进行定点突变并进行体外酶活测定，经筛选后首次获得了一种酶活提高的甲基转移酶突变位点及酶突变体，有效提高了甲基转移酶酶活和麦角硫因产量，为麦角硫因工业化生产提供一种新的甲基转移酶突变体及工程菌。
[0006]一方面，本申请提供了一种甲基转移酶突变体，所述甲基转移酶突变体包括下述A1）
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A3)中任一种：A1) 包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变的蛋白质：第58位、第203位，其中各氨基酸位置编号由参比序列定义，所述参比序列如SEQ ID No.1所示；A2）为由A1）所述蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所述蛋白质具有90％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；A3）为在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0007]优选的，A2）的蛋白质与A1）中限定的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上序列同一性。
[0008]本领域技术人员可以理解的是，本申请中蛋白质编码规则遵循常用规则，以第58
位为例，所述第58位突变即指自参比序列N端开始向C端方向顺序计数第58个氨基酸位点。
[0009]进一步的，所述第58位脯氨酸残基突变为亮氨酸残基；和/或，所述第203位缬氨酸残基突变为天冬酰胺残基。
[0010]进一步的，所述甲基转移酶突变体包括如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列和/或如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。
[0011]另一方面，本申请还提供了生物材料，所述生物材料包括下述B1）
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B6）中任一种：B1）核酸分子，所述核酸分子编码上述甲基转移酶突变体；B2）表达盒，所述表达盒含有B1）所述核酸分子；B3）重组载体，所述重组载体含有B1）所述核酸分子和/或B2）所述表达盒；B4）重组微生物，所述重组微生物含有B1）所述核酸分子、B2）所述表达盒、和/或B3）所述重组载体；B5）重组细胞，所述重组细胞含有B1）所述核酸分子、B2）所述表达盒、和/或B3）所述重组载体；B6）全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有B1）所述核酸分子、B2）所述表达盒、B3）所述重组载体、B4）所述重组微生物、和/或B5）所述重组细胞。
[0012]本文所述表达盒中还可包含启动子、终止子、标记基因等功能性元件，本领域技术人员可根据实际情况进行常规选择，只要能够完成B1）所述核酸分子的表达即可，此处不再对表达盒的结构及组成进行过多限制。
[0013]本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）或病毒载体。具体可为载体pET30a和/或pACYC
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PSC101
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Ptac质粒。
[0014]本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）、产碱菌属（Alcaligenes sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽胞杆菌属（Bacillus sp.）、短杆菌属（Brevibacterium sp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）、气杆菌属（Aerobacter sp.）、肠杆菌属（Enterobacteria sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、沙门氏菌属（Salmonella sp.）、链霉菌属（Streptomyces sp.）、普罗维登斯菌属（Providencia sp.）等但不限于此。
[0015]本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞，所述细胞可为任何可以合成目的麦角硫因的生物细胞。
[0016]可以理解的是，本领域技术人员可以根据实际情况选择适合的基因编辑系统和基因编辑方法完成所述突变改造。
[0017]进一步的，B1）所述的核酸分子包括下述C1）
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C5）中任一种：C1）编码上述甲基转移酶突变体的核酸分子；C2）编码SEQ ID No.3或SEQ ID No.5氨基酸序列的核酸分子；C3）核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的核酸分子；C4）与C1）
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C3)中任一所述核酸分子具有98%或98%以上同一性，且编码上述甲基转移酶突变体的核酸分子；
C5）在严格条件下与C1）
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C3)中任一所述核酸分子杂交，且编码上述甲基转移酶突变体的基因组DNA分子。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种甲基转移酶突变体，其特征在于，所述甲基转移酶突变体包括下述A1）
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A3)中任一种：A1) 包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变的蛋白质：第58位、第203位，其中各氨基酸位置编号由参比序列定义，所述参比序列如SEQ ID No.1所示；A2）为由A1）所述蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所述蛋白质具有90％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；A3）为在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的甲基转移酶突变体，其特征在于，所述第58位脯氨酸残基突变为亮氨酸残基；和/或，所述第203位缬氨酸残基突变为天冬酰胺残基。3.根据权利要求2所述的甲基转移酶突变体，其特征在于，所述甲基转移酶突变体包括如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列和/或如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。4.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述B1）
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B6）中任一种：B1）核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述甲基转移酶突变体；B2）表达盒，所述表达盒含有B1）所述核酸分子；B3）重组载体，所述重组载体含有B1）所述核酸分子和/或B2）所述表达盒；B4）重组微生物，所述重组微生物含有B1）所述核酸分子、B2）所述表达盒、和/或B3）所述重组载体；B5）重组细胞，所述重组细胞含有B1）所述核酸分子、B2）所述表达盒、和/或B3）所述重组载体；B6）全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有B1）所述核酸分子、B2）所述表达盒、B3）所述重组载体、B4）所述重组微生物、和/或B5）所述重组细胞。5.如权利要求4所述的生物材料，其特征在于，B1）所述的核酸分子包括下述C1）
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C...
【专利技术属性】
技术研发人员：张君丽，穆事成，娄双颜，张一鸣，陶文文，王瑞妍，
申请(专利权)人：北京华熙荣熙生物技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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