原位两相提取系统技术方案

本发明专利技术涉及类视黄醇的发酵生产，所述类视黄醇包括视黄醇或视黄醇乙酸酯，所述发酵生产包括：在两相培养系统中，在作为第二相的植物油存在下，培养产生类视黄醇的宿主细胞，例如真菌宿主细胞，特别是油质宿主，例如耶氏酵母属。植物油中存在的类视黄醇可以在没有进一步分离或纯化步骤的情况下用作食品、饲料、制药或化妆品工业中的活性成分。或化妆品工业中的活性成分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原位两相提取系统
[0001]本专利技术涉及类视黄醇的发酵生产，所述类视黄醇包括视黄醇或视黄醇乙酸酯，所述发酵生产包括：在两相培养系统中，在作为第二相的植物油存在下，培养产生类视黄醇的宿主细胞，例如真菌宿主细胞，特别是油质宿主，例如耶氏酵母属(Yarrowia)。包含类视黄醇的植物油可以在没有进一步分离和/或纯化步骤的情况下直接用作食品、饲料、制药或化妆品工业中的成分。
[0002]类维生素，包括维生素A，是人类非常重要和不可或缺的营养因子之一，必须通过营养来提供。类视黄醇物质促进人类的健康，特别是在视力、免疫系统和生长方面。视黄醇乙酸酯是维生素A生产过程中的重要中间体或前体。
[0003]类视黄醇——包括维生素A及其前体——目前的化学生产方法，具有一些不期望的特征，例如高能量消耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年里，已经研究了包括微生物转化步骤的其他制造类视黄醇——包括维生素A及其前体——的方法，这将使得维生素A的生产更经济和生态化。
[0004]一般而言，产生类视黄醇的生物系统在工业上是难以处理的，和/或产生的化合物水平如此之低以至于商业规模的分离是不可行的。最具限制性的因素包括这种生物系统中中间体的不稳定性和/或相对高产量的副产物，例如视黄醇脂肪酸酯，特别是使用在作为碳源的甘油三酯上生长的油质宿主细胞的情况下，更是如此。
[0005]为了避免类视黄醇发酵生产中的一些问题，已经开发了所谓的两相培养系统，其中发酵产物在所谓的第二相亲脂性溶剂中在细胞外收集，所述第二相亲脂性溶剂例如硅油或正十二烷(见WO2020141168或Jang等人,Microbial Cell Factories 10:59,2011)。
[0006]遗憾的是，这些溶剂基于合成或石油化合物，因此考虑到生态、经济、健康和安全问题，应避免使用。
[0007]因此，寻找更环保和可持续的生物维生素A生产工艺是一项持续的任务，其中通过更多的“天然”溶剂，包括使用植物基第二相溶剂，从宿主细胞原位提取宿主细胞外分泌或积累的发酵产物。
[0008]令人惊讶的是，我们现发现了一种原位提取发酵生产的类视黄醇的新方法，所述类视黄醇包括视黄醇或视黄醇乙酸酯，所述新方法特别是用真菌宿主细胞，例如油质酵母，特别是耶氏酵母属提取，所述宿主细胞在植物基第二相作为第二相溶剂的存在下培养的，所述植物基第二相例如植物油，如玉米油。使用宿主细胞在例如葡萄糖或乙醇上生长的这种方法，与使用硅油作为第二相的方法相比，总类视黄醇的积累可以增加至少约10％的范围。
[0009]如本文所用，术语“包含植物油的溶剂”或“包含硅油的溶剂
””
是指植物油和硅油的百分比分别至少在约90％的范围内，优选在约95％、98％、99％或100％(v/v)的范围内。
[0010]如本文所用，术语“分泌”是指分子通过质量作用或从细胞中的脂质扩散到第二相的脂质中的运动。
[0011]合适的植物基第二相溶剂可以选自任何植物油，包括但不限于：油酸、棕榈酸、硬
脂酸或亚油酸和甘油，例如玉米油、橄榄油、棉籽油、油菜籽(rapseed)油、芝麻油、芥花籽(canola)油、红花油、向日葵油、大豆油、葡萄籽油或花生油，优选玉米油。
[0012]用于本专利技术的碳源可以选自线性烷烃、游离脂肪酸、乙醇、葡萄糖和/或其混合物。
[0013]用于本专利技术的合适宿主细胞可以选自能够产生类视黄醇的宿主细胞，特别是产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，例如真菌宿主细胞，包括油质酵母细胞，例如冬孢酵母属(Rhodosporidium)、油脂酵母属(Lipomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选耶氏酵母属，更优选解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，优选地，包含内源性脂肪酶活性的一种或多种遗传修饰，例如降低或消除参与将视黄醇转化为视黄醇脂肪酸酯(fatty acid retinyl esters，FARE)——这是发酵类视黄醇生产中的一种主要不希望的副产物——的内源性脂肪酶的活性，和/或表达编码异源酶EC类[EC 2.3.1.84]的基因，所述异源酶EC类催化视黄醇酶促转化为视黄醇乙酸酯。表达这种乙酰基转移酶(acetyl transferase，ATF)的合适菌株描述于例如WO2019058001或WO2020141168中。
[0014]因此，在一个实施方案中，本专利技术涉及类视黄醇的发酵生产，所述类视黄醇包括视黄醇和视黄醇乙酸酯，其中在合适的碳源上生长的宿主细胞在植物基第二相的存在下培养，所述合适的碳源包括例如线性烷烃、游离脂肪酸、葡萄糖、乙醇和/或其混合物，所述植物基第二项特别是植物油，所述宿主细胞在内源性脂肪酶活性上修饰，特别是其中一种或多种编码具有与耶氏酵母属LIP2和/或耶氏酵母属LIP3和/或耶氏酵母属LIP4和/或耶氏酵母属LIP8等同活性的酶的内源性基因的活性被降低或消除，例如与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或其组合具有至少约50％，例如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的多肽，其中SEQ ID NO:1对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP2，SEQ ID NO:3对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP3，SEQ ID NO:5对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP8，SEQ ID NO:7对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP4。优选地，如本文所述的包含本文所定义的植物油作为第二相的方法在与耶氏酵母属LIP8的活性相对应脂肪酶的活性上修饰，例如特别是具有与来自解脂耶氏酵母属的LIP8相对应活性的编码脂肪酶的基因具有降低或消除，更特别是消除的活性，更优选地，其中与SEQ ID NO:5具有至少约50％同一性的多肽被消除。
[0015]如本文中所使用的，本文所定义的具有“降低或消除”活性的酶，特别是脂肪酶，意指其比活性的降低，即在发酵过程中催化产物从给定底物形成甘油和脂肪酸的能力的降低/消除，包括编码这种脂肪酶的相应(内源性)基因的活性降低或消除。100％的降低在本文中称为酶活性的消除，例如通过编码所述酶的内源性基因中的缺失、插入、移码突变、错义突变或过早终止密码子或用已知方法阻断所述内源性基因的表达和/或活性来实现。
[0016]如本文中所使用的，导致基因活性消失的基因的“缺失”包括核酸序列中可能导致功能减弱的等位基因的所有突变，包括但不限于缺失、插入、移码突变、错义突变和过早终止密码子，其中缺失意味着在宿主细胞中不能(再)检测到相应的基因/蛋白质活性，例如特别是内源性脂肪酶活性。
[0017]本文定义的遗传修饰包括但不限于，例如，基因置换、基因扩增、基因破坏、转染、使用质粒、病毒或其他载体的转化。这种基因修饰的实例可以例如影响与DNA的相互作用，该相互作用由本文定义的酶的N末端区域介导，或者影响与其他效应分子的相互作用。特别地，导致特异性酶活性降低/被消除的修饰可以在蛋白质的功能性部分中进行，例如对催化
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.在发酵过程中原位提取类视黄醇的方法，所述方法包括：在包含植物油的第二相亲脂性溶剂的存在下培养宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，优选油质酵母，更优选耶氏酵母属。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞在碳源上生长，所述碳源选自葡萄糖或乙醇。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中与使用硅油作为第二相亲脂性溶剂的方法相比，类视黄醇的百分比增加了至少约10％。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述溶剂用于收集和提取发酵产生的类视黄醇。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵生产的类视黄醇包含基于总类视黄醇计的至少约0.001％至约30％的百分比的视黄醇乙酸酯。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物油选自油酸、棕榈酸、硬脂酸或亚油酸和甘油，优选选自玉米油、橄榄油、棉籽油、油菜籽油、芝麻油、芥花籽油、红花油、葵花籽油、大豆油、葡萄籽油和花生油，更优选选自玉米油。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自油质宿主细胞，所述油质宿主细胞包括红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、油脂酵母属(Lipomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：