一种利用固定化羟化酶转化制备25-羟基维生素D3的方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种利用固定化羟化酶转化制备25

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化羟化酶转化制备25
‑
羟基维生素D3的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种利用固定化羟化酶转化制备25
‑
羟基维生素D3的方法。

技术介绍

[0002]维生素D3是生物体内的一种重要脂溶性维生素，其主要作用是作为钙磷调控的前体物质。生物体内的7
‑
脱氢胆甾醇在紫外波长的照射下，环戊烷多氢菲结构9号位开环形成维生素D3的结构。生物体内的维生素D3不具有生物活性，并且不会在血液中长期运转，而是迅速被脂肪组织吸收储存或者运往肝脏进一步进行合成代谢(孙俊等2015)。维生素D3在人体中经过羟化反应转变为其活性形式25
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羟基维生素D3及1α，25
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羟基维生素D3的发现被认为是20世纪末维生素领域最重大的研究成果。
[0003]随着研究发现，维生素D3作为代谢合成中活性激素，因此具有更为广阔的生物活性与药用价值，国际上掀起了一股化学合成法热潮。目前主流的化学合成法，是由Method.F提出的以维生素D3的相似结构物质胆甾醇，经过一系列化学修饰、取代、加氢等20个步骤合成1α，25
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羟基维生素D3，但是最终的产率却是非常低，只有1％左右(Zhu G D,Okamura W H等1995)。化学合成法本身合成效率低，污染大，甾醇母核结构羟化立体选择性较差。面对医药市场对维生素D3活性物质的需求日益增长，急需一种高效的方法取代化学合成法。
[0004]微生物转化法利用的菌株主要包括有链霉菌属、红球菌属、分枝杆菌属、诺卡氏菌属和酵母菌属等。微生物转化法成本低，对环境污染小，具有高度的立体选择特异性，能够极大的缩短化学合成反应步骤，被认为在复杂的反应过程中具有广泛的应用前景。
[0005]目前为止，工业生产上，对甾醇的11α,11β和16α进行羟化生产活性药物已经得到广泛应用(Mahato S B等1997)，为维生素D3羟化酶转化生产25
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羟基维生素D3产业化提供了非常好的先例。
[0006]然而由于维生素D3极低的水溶性，成为限制维生素D3羟基化反应速率的主要制约因素。现有微生物发酵法也存在如下不足之处：
①
投料浓度较低。由于菌体细胞对高浓度有机溶剂及表面活性剂的低耐受性，导致投料浓度受限。
②
产物提取纯化工艺复杂，产品终收率较低。发酵法中产物25
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羟基维生素D3主要被菌体吸附，需要对菌体进行全细胞反复萃取来提取产物，而大量菌体富含的杂质如色素、脂类和蛋白也被同时萃取出来，使后续需要较为复杂的提取精制工艺，才能获得纯度较高的25
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羟基维生素D3。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种利用固定化羟化酶转化制备25
‑
羟基维生素D3的方法，用以解决现有发酵制备25
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羟基维生素D3的方法投料浓度较低，发酵废水量较大，产品终收率较低等问题。
[0008]本专利技术提供一种用于固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的转化体系，所述转化体系的原料包括以下组分：葡萄糖0.5
‑
1.5g/L，乳化剂30.0
‑
50.0g/L,维生素D3 25
‑
50g/L和分散剂0.5
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1.5g/L；
[0009]所述转化体系的pH值为7.0
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7.5。利用本专利技术的转化体系，可以提高投料浓度、转化率，缩短转化时间，用水量少、减少废水量。
[0010]优选的，所述乳化剂为蓖麻油聚氧乙烯醚或脂肪醇聚氧乙烯醚。
[0011]优选的，所述分散剂为聚乙二醇，进一步优选为聚乙二醇200或聚乙二醇400。利用本专利技术所述分散剂与乳化剂，可以有效提高羟基化反应速率。
[0012]优选所述转化体系中还包括缓冲液。
[0013]进一步优选所述转化体系中包括磷酸盐缓冲液和MgSO4。
[0014]更进一步优选的，所述磷酸盐缓冲液包括Na2HPO4和KH2PO4。再进一步优选包括Na2HPO
4 1.40
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1.49g/L和KH2PO40.22
‑
0.26g/L。
[0015]更进一步优选包括MgSO
4 0.05
‑
0.015g/L。
[0016]优选的,所述转化体系中包括Na2HPO
4 1.4g/L,KH2PO40.24g/L和MgSO
4 0.05
‑
0.015g/L。
[0017]优选的，所述转化体系中还包括原料B，所述原料B是醇类和水的混合液。
[0018]进一步优选的，所述原料B中含有70
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95w％醇类，余量为水。
[0019]本专利技术还提供一种利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，利用所述转化体系。本专利技术用特异性固定化酶催化的方法，可以减少对菌体和菌体破碎后产品后期处理工艺影响，生产工艺简单，能够得到较高纯度的25
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羟基维生素D3，并且固定化羟化酶可以多次重复使用。
[0020]根据本专利技术所述利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，固定化羟基酶与转化体系的比例为1g:(50
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150)mL。
[0021]根据本专利技术所述利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，转化过程中：控制反应温度为30
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35℃，转速为100
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220r/min，转化时间为12
‑
16h。
[0022]根据根据本专利技术所述利用固定化羟化酶转化制备25
‑
羟基维生素D3的方法，在转化过程中加入维生素D3羟化酶的辅因子；
[0023]所述辅因子为NADPH，NADH和维生素C的一种或几种混合物。
[0024]根据本专利技术所述利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，利用产维生素D3羟化酶的基因工程菌制备固定化羟基酶。
[0025]优选的，所述基因工程菌为酵母菌、大肠杆菌或自养无支酸菌中的一种。
[0026]进一步优选的，所述基因工程菌为酵母菌。
[0027]根据本专利技术所述利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，在制备固定化羟化酶之前还包括羟化酶诱导步骤。
[0028]根据本专利技术所述利用固定化羟化酶转化制备25
‑
羟基维生素D3的方法，所述固定化羟化酶的制备方法包括以下步骤：
[0029](1)对产维生素D3羟化酶基因工程菌的菌悬液进行细胞破碎，经离心或过滤，得到上清液；
[0030](2)向步骤1)得到的上清液依次加入海藻酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的转化体系，其特征在于，所述转化体系的原料包括以下组分：葡萄糖0.5
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1.5g/L，乳化剂30.0
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50.0g/L,维生素D3 25
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50g/L和分散剂0.5
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1.5g/L；所述转化体系的pH值为7.0
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7.5。2.根据权利要求1所述用于固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的转化体系，其特征在于，所述乳化剂为蓖麻油聚氧乙烯醚或脂肪醇聚氧乙烯醚；和/或，所述分散剂为聚乙二醇，进一步优选为聚乙二醇200或聚乙二醇400；优选还包括缓冲液；进一步优选包括磷酸盐缓冲液和MgSO4；更进一步优选的，所述磷酸盐缓冲液包括Na2HPO4和KH2PO4；再进一步优选包括Na2HPO
4 1.40
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1.49g/L和KH2PO40.22
‑
0.26g/L；更进一步优选包括MgSO
4 0.05
‑
0.015g/L。3.一种利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述转化体系；优选的，固定化羟基酶与转化体系的比例为1g:(50
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150)mL。4.根据权利要求3所述利用固定化羟化酶转化制备25
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羟基维生素D3的方法，其特征在于，在转化过程中加入维生素D3羟化酶的辅因子；所述辅因子为NADPH，NADH和维生素C的一种或几种混合物。5.根据权利要求3
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4任一项所述利用固定化羟化酶转化制备25
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【专利技术属性】
技术研发人员：孟国庆，郭燕风，刘京国，任兆龙，
申请(专利权)人：北京泛球生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：