制备熊胆酸的微生物方法技术

本发明专利技术涉及一种制备熊胆酸的微生物方法，包括在特定微生物存在下β

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备熊胆酸的微生物方法
[0001]详细说明本专利技术涉及从植物来源的甾醇开始制备熊胆酸的微生物方法。
[0002]胆酸是一种主要的胆汁酸，在肝脏中由胆固醇通过多种互补的酶过程合成。胆汁酸包括一组具有相似化学结构的分子种类，它们被分泌到胆汁中并运输到小肠腔中，在那里它们作为乳化剂促进脂肪的消化和吸收，以及通过能够控制不同信号通路的内分泌分子。
[0003]胆汁酸的合成代表了胆固醇分解代谢的主要代谢途径：17种酶参与了这些分子的产生。被定义为初级的最终产物，如胆酸和鹅去氧胆酸，可以被肠道细菌修饰，形成二级胆汁酸，如熊去氧胆酸，反过来，可以被重新吸收，并通过肠
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肝循环返回肝脏。这是一种严格控制的合成，以确保足够量的胆固醇被分解，以维持肠道内的稳态，并提供足够的乳化。
[0004]与胆汁酸参与各种疾病的病因和发病机制相反，这些化合物的物理化学和生物特性使它们能够用于药物开发和释放活性物质的药理“工具”。
[0005]胆汁酸对健康的有益作用和治疗用途自古以来就为人所知。特别是，临床研究已经证明了它们的治疗效果，特别是熊去氧胆酸在治疗广泛的胆汁淤积性肝病方面的疗效。在20世纪，只有熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸被使用。然而，在本世纪末，随着胆汁酸激活法尼索X核受体(FXR)的能力的发现，其有效的治疗潜力被认识到。2016年，美国食品和药物管理局(FDA)批准将胆酸用于先天性胆汁酸合成障碍，并作为包括齐薇格的脑肝肾综合征在内的过氧化物酶体疾病的额外治疗方法。同年，奥贝胆酸作为FXR的强选择性激动剂，被批准用于治疗对熊去氧胆酸治疗反应不理想的原发性胆汁性肝硬化患者。
[0006]在过去的十年中，许多胆汁酸的衍生物被合成和表征;事实上，这是全世界生物医学研究中一个不断发展和有前途的领域。
[0007]迄今为止，唯一经济上可行的胆汁酸资源是牛胆汁，必须在屠宰时提取。在屠宰场，牛胆囊在肉类加工过程中被回收，从一头牛身上可以获得约230毫升的胆汁，其中胆汁酸约占0.7% (w / w)。
[0008]只有提取胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯和游离脂肪酸后，胆汁酸才能从无机盐中分离出来。为了提取和纯化不同的胆汁酸，主要是初级胆汁酸，将胆汁冷冻和冻干：从100 mL胆汁中可获得8 g干粉。从中可获得约6.9 g纯度为90%的胆汁酸，仅在随后通过化学转化过程，才有可能获得熊去氧胆酸等结肠衍生物(Beilstein J. Org. Chem. 2018, 14, 470
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483)。
[0009]这一过程在成本和环境影响方面带来了相当大的问题。一个主要问题涉及合成肠绞痛衍生物的前体的供应：牛肉的主要生产者位于新兴工业化国家，特别是在南美洲(巴西)和印度，那里往往缺乏适当的技术条件和卫生规程，导致环境污染，并需要在胆汁酸的处理中纳入卫生程序。此外，近年来，原料价格持续大幅上涨，影响到成品，成品对制药公司来说太贵了，而制药公司又受到各组织和各国卫生服务部门的价格管制，相反，这些机构支持降低价格的政策。
[0010]因此，有必要确定和开发可转化衍生物的替代来源，以确保高产量和有竞争力的
成本，降低合成所需的复杂性和步骤数量，增加产品的安全性。
[0011]本申请的专利技术人令人惊讶地发现了一种制备熊胆酸的方法，熊胆酸是合成胆汁酸的重要前体，其化学结构与胆酸的化学结构不同之处在于7号位置的羟基构型相反，这就克服了上面所述的缺点。
[0012]事实上，这种方法只涉及一个步骤，涉及植物来源的甾醇β
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谷甾醇与微生物在合适的培养液中的生物转化。到目前为止，似乎还没有关于生产熊胆酸的微生物过程的报道。
[0013]因此，本专利技术的主题是一种制备式(I)熊胆酸的微生物方法，包括在微生物存在的条件下，式(II)的β
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谷甾醇的生物转化。谷甾醇的生物转化。
[0014]经过大量的实验，本申请的专利技术者已经确定了特定的微生物，使其有可能在一个步骤中获得高纯度的熊胆酸，即超过90%。
[0015]在稍后将描述的特定实验条件下，本专利技术过程中使用的微生物允许同时减少β
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谷甾醇位置5,6上的双键，引入位置7β和12α上的两个羟基，并氧化支链烷基链形成末端羧酸，而无需使用长时间的合成步骤，否则为了获得所需的产品必须降低产量。因此，根据本专利技术的过程具有高度的区域和立体选择性。
[0016]根据本专利技术，适用于制备熊胆酸的微生物是一种真菌菌株。
[0017]优选，所述真菌菌株选自Trametesspp.,Botryosphaeriarhodina,Pleurotusostreatus和Pleurotusincarnatus,更优选选自Trametesspp.野生型,BotryosphaeriarhodinaDSM 62078,BotryosphaeriarhodinaDSM 62079,PleurotusostreatusCBS 342.69,PleurotusincarnatusCBS 498.76,更进一步优选PleurotusincarnatusCBS 498.76。
[0018]根据本专利技术优选的真菌菌株与符合布达佩斯条约的生物体的备案号进行了鉴定，如DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)和CBS
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KNAW。
[0019]这些微生物可用作冻干菌或从储存它们的培养基中分离出来的新鲜培养物。
[0020]技术人员都知道，为了确保微生物的适当生长，从而确保微生物过程的效率，有必要在特定的温度和pH条件下使用适当的培养液。
[0021]可以在本专利技术过程中使用的培养液的例子有Donova, SAWADA和Bushnell
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Haas Broth，具有以下成分：
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Donova：蔗糖、 KH2PO4、MgSO4x 7H2O、玉米浆、H2O；
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SAWADA：燕麦粉, NaNO3、KH2PO4、 MgSO4x 7H2O、FeSO4x 7H2O、MnSO4x 7H2O、H2O；
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Bushnell
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Haas Broth：MnSO4、 CaCl2、KH2PO4、 K2HPO4、NH4NO3、 FeCl3。
[0022]这些培养液可以在市场上买到，也可以根据罗纳德
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阿特拉斯的《环境微生物培养基手册》中描述的方法制备，CRC出版社(1995年)。
[0023]为了完成本专利技术的生物转化，微生物以1 mg / L和100 mg / L之间的浓度存在于上述培养液中，优选是在10 mg / L和50 mg / L之间。
[0024]本专利技术的微生物方法，或从植物来源的甾醇开始制备熊胆酸，优选在约28
°
C的温度和约pH7.0的条件下进行。
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备式(I)熊胆酸的微生物方法，包括在Pleurotus incarnatus存在的条件下，式(II)的β
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谷甾醇的生物转化，谷甾醇的生物转化，。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Pleurotus incarnatus 为 Pleurotus incarnatus CBS 498.76。3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述生物转化发生在适当的培养液中，优选从Donova、SAWADA、Bushnell
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Haas中选择。4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述Pleu...

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔，
申请(专利权)人：凯梅莱克蒂瓦有限责任公司，
类型：发明
国别省市：